常规真核表达与鉴定

《常规真核表达与鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、1常规真核表达与鉴定——刘宗梁2013-10-192一、真核表达概述；二、常用真核表达系统；三、细胞与载体的选择；四、哺乳动物细胞转染；五、Western-blot法对转染结果的检测；六、间接免疫荧光法（IFA）对转染结果的检测；七、Cell-ELISA法对转染结果的检测；主要内容：3一、真核表达概述1、真核表达：通过将外源基因克隆到真核表达载体，并转染到合适的真核细胞中，最终获得外源目的基因高效表达产物的过程。2、真核表达相对原核表达的优点：在真核表达的过程中，可以通过真核细胞的转录及修饰系统（如甲基化修饰

2、、糖基化修饰、乙酰化修饰等）获得具有一定构象和生物活性的蛋白质；表达目的蛋白更的结构及生物学功能（如免疫原性等）更接近于该蛋白的天然状态，且表达的蛋白不存在原核表达中“包涵体”这一现象。3、真核表达缺点：表达量低，一般难以持久表达。4二、常用真核表达系统1、毕赤酵母表达体系：酵母细胞表达系统蛋白表达水平高，生产成本低，但纯化难度大。2、慢病毒表达系统：商品化的慢病毒表达系统（如Lenti-X）在病毒包装时获得VSV-G泛嗜性重组慢病毒，通过膜质偶联和膜质融合的方式感染靶细胞，可感染几乎所有类型的哺乳动物细胞。

3、3、哺乳动物细胞表达体系：对蛋白的加工与修饰与酵母及昆虫表达系统完全不同，可通过脂质体等直接将外源表达质粒导入哺乳动物细胞，进行表达。哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白，但其表达量低。54、杆状病毒昆虫细胞表达体系：蛋白表达水平高，可长晶体，多用于蛋白结果与功能的研究，但重组质粒构建及融合十分复杂。6三、细胞与载体的选择1、常用于表达的哺乳动物细胞：COS-7、BHK、293T、Sf-9、Sf-21等，具体选择可根据实际需要或者表达载体所含的表达原件等进行选择。2、表达质粒的选择：常用的真核表达质粒有p

4、CAGGS、pCDNA3.1、pEGFP等（均为SV40origin）。3、某些特殊的表达载体：如反向遗传表达载体，昆虫表达系统载体等。7四、哺乳动物细胞转染1、引物设计：构建重组真核表达质粒，一般在引物设计时首先会在引物中引物一些能够促进蛋白表达（如Kozak序列）或者便于后期检测的序列或标签（如flag、HA、His等），注意这些序列在引物中的位置。2、实验材料：真核表达细胞系、DMEM、FBS、OPTI-MEM、PBS、trypsin、携带有外源基因的重组质粒（去细胞内毒素法抽提）、转染试剂（或仪器）、

5、细胞计数器、盖玻片、六孔板等。3、转染细胞密度约2～5×106/mL,一般在细胞铺板后12～18h内进行转染，转染的质粒要测定浓度，按2ug/孔进行。8细胞转染步骤——以DFV-E基因转染cos-7细胞为例1、cos-7细胞消化后计数，铺六孔板，培养12～24h，观察细胞生长情况，至适宜密度(铺板后的细胞尽可能在24h内进行转染，一般选择过夜)即可进行转染。2、质粒及脂质体处理（1）及脂质体：脂质体为4、6、8uL/孔（脂质体+OPTI-MEM，250ul/1.5tube，孵育5min）（2）质粒：质粒终浓度

6、分别为2、3、4ug/孔（质粒+OPTI-MEM，250ul/1.5tube，不需孵育，在脂质体孵育5min中的过程中，把质粒配好）93、将第二步中（2）加入（1）中，混匀，不要剧烈吹打，孵育20min（在两者作用的20min时间内，洗涤细胞）4、细胞的洗涤：先弃掉原培养液，以维持液DMEM（未加血清）洗涤两遍1mL/孔；再用OPTI-MEM洗涤一遍，约1mL/孔。细胞洗涤也可用预热的PBS或者Hank's液洗涤，最后一遍洗涤最好使用维持液。5、将六孔板中的以上液体弃掉，再加入1.5mL的OPTI-DMEM；

7、将孵育的脂质体及质粒（500uL/孔）均匀滴入其中，轻摇六孔板使之混合均匀。106、将六孔板放入培养箱，一般5～6小时后换液，具体是否要换液根据细胞具体生长状态进行调整。7、弃去原培养液，补加2mL/孔的OPTI-MEM，或者加入2mL/孔的含10%血清的DMEM培养基，继续培养至36～48h。8、培养至48h后收细胞即可停止培养，然后进行表达蛋白的鉴定。若用IFA法检测，则在此处即可进行细胞固定；若进行Westernbolt法检测，则此处需要将细胞消化下来，裂解，然后进行SDS-PAGE，最终通过WB检测。

8、9、转染时注意做空白细胞对照和空质粒转染对照。11五、Western-blot法对转染结果的检测1、培养至48h后收细胞(视细胞状态决定何时收集细胞)，弃去六孔板中的培养液，然后以胰酶消化500uL/孔、作用1min。2、以预冷的PBS反复吹打洗脱细胞，PBS1mL/每孔(最好再用PBS500uL重复洗细胞孔一次，彻底收集所有的细胞)，为了提高细胞量，可做两转染孔合一管。3、吸取消化下来的细胞于1.