人细胞因子受体样因子3在真核及原核细胞中的表达

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1、人细胞因子受体样因子3在真核及原核细胞中的表达作者：赵艳,段素素,车昌艳,张蕾,张云,王树蕙,刘力【摘要】　　目的:观察CRLF3蛋白在293T细胞中的表达及亚细胞定位,并在大肠杆菌中表达和纯化了重组CRLF3蛋白。方法:将真核表达载体pCMVmycCRLF3瞬时转染293T细胞,转染24h和48h后免疫荧光染色,共聚焦显微镜观察蛋白表达及定位;构建原核表达质粒pGEX4T1CRLF3,实现插入基因的融合表达,经GST亲合层析纯化蛋白。结果:CRLF3蛋白在293T细胞中高效表达,主要分布在细胞质和细胞膜;成功构建了表达CRLF3融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌内高效表

2、达,纯化后得到Mr约为74000的融合蛋白。结论:在真核细胞中过表达的CRLF3蛋白主要定位在细胞质和细胞膜;获得了重组GSTCRLF3融合蛋白,为进一步探讨CRLF3的功能奠定基础。【关键词】人细胞因子受体样因子3真核表达原核表达蛋白纯化　　[Abstract]AIM:Cytokinereceptorlikefactor3(CRLF3)isanovelgeneclonedfromK562cellline.TheaimofthecurrentstudyistoobserveCRLF3expressionandsubcellularlocalizationin293Tcellsan

3、dtoexpressandpurifytheCRLF311fusionproteininE.coli.METHODS:TheplasmidpCMVmycCRLF3wastransientlytransfectedinto293Tcell.TheexpressionandlocalizationofCRLF3proteinwasobservedbyimmunostainingapproach.CRLF3wasalsoclonedintopGEX4T1vector.TheGSTCRLF3fusionproteinwasexpressedinE.coliandpurifiedby

4、GSTaffinitychromatography．RESULTS:CRLF3proteinwashighlyexpressedintransfected293Tcells.CRLF3proteinwasdistributedinbothcytoplasmandcellmembrane.TheGSTCRLF3fusionproteinwasexpressedasaMr74000proteinandthensuccessfullypurifiedfromE.colicells.CONCLUSION:OverexpressedCRLF3isacytoplasmicproteinthat

5、distributesinbothcytoplasmandcellmembraneinmammaliancells.TherecombinantGSTCRLF3fusionproteinhadbeenisolatedandcouldbeusedforfurtherantibodyproductionandfunctionalcharacterization.　　[Keywords]CRLF3;eukaryoticexpression;prokaryoticexpression;proteinpurification　　人细胞因子受体样因子3（cytokinereceptorlik

6、efactor3,CRLF3）是一个具有I类细胞因子受体保守功能域的新基因。本实验室从K562细胞中克隆出CRLF3[1],并提交NCBI11GenBank（DQ298450）。CRLF3基因编码区全长1317bp,编码一个438个氨基酸的蛋白质。生物信息学分析CRLF3定位在17q11.2,具有一个重要的结构域——FN3功能域,这一结构域的C末端,有一个RGD基序和I类细胞因子受体特有的WSXWS基序,CRLF3基因保守存在于多种生物中。对CRLF3的功能研究表明CRLF3的过表达可以抑制细胞周期,使细胞停滞在G0/G1期,减少了进入S期的细胞,其作用机制尚不明确。CRLF3可能

7、是一种交通信号分子。本研究中,我们将CRLF3基因在真核细胞中表达,观察了CRLF3在真核细胞中的定位,并在原核细胞中表达和纯化了其融合蛋白,为进一步研究CRLF3的功能奠定基础。　　1材料和方法　　1.1材料真核表达质粒pCMVmycCRLF3、人胚肾293T细胞、融合表达载体pGEX4T1、E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)均由本室保存;MEM、胎牛血清购自Gibco公司;T4连接酶、BamHI、XhoI限制性内切酶、λEc