密码子优化的隔孢伏革菌植酸酶基因在毕赤酵母中高效表达-论文.pdf

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1、HORIZONOFSCIENCEANDTECHNOLOGYl科技视野密码子优化的隔孢伏革菌植酸酶基因在毕赤酵母中高效表达陆益新王瑞鲲田永杰吴倩倩李湘鸣(扬州大学医学院)[中图分类号]$816．79[文献标识码]A[文章编号]1002—8358(2015)12—27—4摘要：本研究目标是建立隔孢伏革菌植酸酶(6一既能提高对磷的利用率，又能减少磷污染。但是，传phyA)分泌表达量高的毕赤酵母株，其作为饲料添加剂，可统的植酸酶多数是3一磷酸植酸酶，耐高温性差，在促进单胃类动物消化道对饲料磷的吸收．减少家畜粪便中磷日常的饲料的加工中．容易被灭活，商业性植酸酶又对环境的污染．又可满足

2、饲料加工的需要。按照毕赤酵母对有提纯困难、产量低、成本高等特点。隔孢伏革菌植遗传密码子的偏好性．利用重叠PCR方法人工合成6一酸酶(Peniophoralycii)是一种6一磷酸植酸酶(6一phyA．将其插入到pPIC9K栽体，构建成6一phyA整合型毕phyA)，对高温、低pH具有较强的耐受性，故本研究赤酵母表达载体．通过电转化转入GS115酵母细胞．并筛选通过分子生物学技术将隔孢伏革菌植酸酶基因重组出Mut高拷贝转化子。通过SDS—PAGE分析，发现在该酵母细胞克隆株的发酵液中．见有一明显6一phi／rA条带，经测于毕赤酵母中，使得植酸酶基因得到高效表达，从而表达产物酶

3、活性．发现均为对照酵母株的7．5倍以上，说明有望进一步减少磷对环境的污染四。6-phvA在所构建的毕赤酵母株中成功、有效的表达。关键词：隔孢伏革菌植酸酶；毕赤酵母；密码子偏好1材料与方法1．1隔孢伏革茵植酸酶基因6-phyA的合成磷是动物生长、繁殖所必需的营养元素之一，根据GenBank隔孢伏革菌(Peniophoralycii)植但畜禽常规植物性饲料中约有60％～80％的磷是以酸酶编码序列，依据毕赤酵母所嗜好的密码子设计植酸磷的形式稳定存在于植酸盐复合物中，这些磷引34条引物．并分别在第一条和第34条引物的5只有在植酸酶的作用下才能被游离出来供畜禽吸端增加SnaBI和No

4、tI酶切位点，利用重叠延伸收利用。但是猪、鸡等单胃动物消化道中缺乏植酸PCR方法合成隔孢伏革菌植酸酶基因。酶，对植酸磷的利用能力很低，绝大数随粪便排出PCR产物经北京天根公司生产的PCR试剂盒体外，对生态环境造成了严重的威胁Ⅲ。同时，植酸纯化。将合成的6-phyA和pUC57用BamHI和磷还是一种抗营养因子，它与多数金属离子及蛋白XholI酶切，用T4连接酶连接，酶切鉴定，测序，将质会形成不溶复合物，严重影响动物对其的吸收与其命名为pUC57／6一phyA。利用f2]。如何既满足动物的磷营养需要，又降低饲料1．2人工合成的6-phyA毕赤酵母密码子嗜好分析成本．减少对环境

5、的污染。已成为现今需解决的问将所测序列递交http：／／www．genscript．com／cgi-题。目前大量研究表明。在动物饲料中添加植酸酶bin／tools／rarecodonanalysis网，对毕赤酵母(P．P_—astoris)密码子组成、分布及密码子的利用频率进行通讯作者：李湘鸣，教授，Email：847264344@qq．con。分析饲料广角·27科技视野lHORIZONOFSCIENCEANDTECHNOLOGY1．36一phyA毕赤酵母表达栽体的构建将PCR鉴定正确Mut酵母表型(GS115／L6一以pUC57／6一phyA为模板．PCR扩增6-phyA

6、ph)~J线接种YPD培养板上，反复传10代后，接种信号肽下游1230bp的DNA序列，引物设计为：上于YPD／G418(5mg／mL)的平板上，30~C培养5-6d，游5一GCTI’ACGTACAATrGCCAATTCCTGCTCAGA使长出直径3—4mm的克隆。挑取酵母克隆于一3：下游5一AACGCGGCCGCTATYCAGATGGGAC5mLMD培养液中．30℃剧烈振荡培养18～20h，取GAAACCAC一3．在引物5端分别增加SnaBI和100p~L菌液于lOmL新鲜的BMGY培养液中继续NotI酶切位点．并增加3个保护碱基。PCR扩增程振荡培养24h，离心收集酵母

7、细胞，垂悬加入20mL序为：94℃预变性5min，94℃变性45S，55℃退火培养液BMMY(含l％甲醇)，30℃下继续诱导培养，45S、72~(2延伸2min，进行3O个循环，循环结束后再每隔24h取2mL样品测定植酸酶的表达活性。每72℃延伸5min．然后进入4℃。PCR产物经试剂盒隔24h添加甲醇，使终浓度达0．5％～l％．于48h后回收纯化，命名为L6ph。分别用SnaBI和NotI对结束。L6ph和pPIC9K进行酶切．酶切产物经试剂盒回收1．6．2SDS—PAGE分析纯化，用T4连接酶连接，连接产物转化