来源于kosakonia radicincitans新型植酸酶基因通过密码子优化在毕赤酵母里高效表达

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1、学校代码：10264研究生学号：M120209517上海海洋大学硕士学位论文来源于Kosakoniaradicincitans新型植酸题目：酶基因通过密码子优化在毕赤酵母里高效表达Codonoptimizationofanovelphytasegene英文题目：fromKosakoniaradicincitansforhigh-levelexpressioninPichiapastoris专业：生物学研究方向：生物化学与分子生物学姓名：李大伟指导教师：姚泉洪二O一五年六月五日上海海洋大学学位论文原创

2、性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人

3、授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：2014年5月20日日期：2014年5月20日1上海海洋大学硕士学位论文中文摘要植酸（肌醇六磷酸）是豆类及谷类等作物种子中磷的主要储存形式，但单胃动物（如家禽、猪等）由于体内缺乏分解植酸的酶而难以有效利的用植酸磷，大部分以植酸形式存在的磷被动物直接排出体外，造成严重的环境污染；同时，

4、植2+2+2+2+酸磷还是一种抗营养因子，它可以和多种金属离子如Ca、Mn、Mg、Zn、2+2+Cu、Fe等以及许多蛋白质螯合成相应的不溶性络合物，降低了这些营养物质的生物有效利用率以及动物对营养物质的有效利用。植酸酶（phytase），即肌醇六磷酸水解酶（myo-inositolhexakisphosphatephosphohydrolase，EC3.1.3.8），是催化植酸（肌醇六磷酸）及其植酸盐水解生成肌醇与磷酸（或磷酸盐）的一类酶的总称，属于组氨酸磷酸酶家族。作为单胃动物饲料添加剂，植酸酶能

5、有效的提高植物性饲料中磷的利用率，进而提高单胃动物对矿质元素的吸收，同时也减轻了动物排泄物中磷对环境的污染。多种微生物如细菌、酵母、丝状真菌等都能够产生植酸酶，但天然生物体中植酸酶含量极其低，难以获得大批量产品。通过基因工程技术构建的植酸酶基因工程菌即可实现植酸酶的高效异源表达，在分子水平上对植酸酶基因进行遗传操作，改善植酸酶的酶学性质如pH最适性、热温度性、催化活性等，提高其在动物体内的有效生物活性，特别是植酸酶的稳定性等，这将对植酸酶的大规模生产和应用开辟更为广阔的前景。本文将来源于Kosako

6、niaradicincitans的植酸酶基因（KrAPPA）在Pichiapastoris表达系统高效表达了有生物活性的胞外植酸酶KrAPPAS。具体实验过程如下：首先根据Kosakoniaradicincitans的植酸酶蛋白序列和毕赤酵母密码子偏爱性设计新的植酸酶基因的核苷酸序列，然后再根据此序列设计一系列的引物，用来合成这个目的基因。将合成好的基因经过大肠杆菌克隆并测序鉴定，结果显示设计的基因序列与野生型的完全一致。新的植酸酶基因与野生型基因之间的核苷酸序列比对结果显示77.7%的同源性。将测

7、序正确的植酸酶基因KrAPPAS连接到pPIC9K表达载体上，利用电击法将基因导入到毕赤酵母GS115细胞中，然后筛选具有高活性的重组酵母转化株，甲醇诱导（浓度为1%）24h后蛋白表达量达到最高，约为45μg/ml，发酵上清液中植酸酶活性达82.27U/mL，比活性为1828.18U/mg，从而实现了植酸酶KrAPPAS基因在Pichiapastoris中的高效分泌表达。通过硫酸铵分级沉淀和Ni2上海海洋大学硕士学位论文离子亲和层析分离纯化出单一的植酸酶重组蛋白，SDS-PAGE结果显示，其分子量约

8、为45kDa，与生物信息学预测理论值大小相当，几乎没有糖基化现象的发生。酶学特性研究结果显示，重组植酸酶的Vmax和Km值分别为1735μmol▪-1-1minmg和0.236mM，最适pH值为3.5，最适温度为55℃，在30-65℃之间，酶相对活性都很高，温度高于60℃后，相对酶活随温度的升高逐渐降低。重组植酸酶的热稳定性比较好，在温度低于65℃时非常稳定，在65℃温育30分钟后酶活剩余90%，当温度超过70℃时，重组植酸酶的稳定性急剧下降，温育仅仅15min2+2