猪胰腺脂肪酶密码子重组优化、毕赤酵母高效表达及酶学特性分析

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1、万方数据SichuanAgriculturalUniversityMasterDissertation／—、1·-·_一一·一‘00donoptimization，highetlectivelyexpresslon．‘^一‘andcharacterizationofarecombinationporclnepancreaticlipase(re—PPL)inPichiapastorisDanChenDirectior：ProfessorHuaZhaoMajor：AnimalnutritionandfeedscienceResearchDirection：．Exploi——t———a———t—

2、——i——o————n—————a————n————d——————u————t．．．i．．1．．i．．z．．．a．．．．t．．．i．．o，．．n．．．．．．o．．．．f．．．．f．．．e．．．e．．．．d．．．．．．r．．．e．．．s．．．o．．．．u．．．．r．．．c．．．．e．．．s．．．．．．Chengdu611130，Sichuan，ChinaMay,2014万方数据论文独创性声明㈣㈣㈥舢㈣㈣删dO1217本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，

3、也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：蚀丹力竹年6只

4、{B关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。矗本论文不保密。口本论文保密，在一年解密后适用本授权。(请在以上口内划“√”)研究生签名：蚀丹导师签名：差叁修如竹年6Bl／

5、日聊唯年6月ff日万方数据摘要猪胰腺脂肪酶(PPL)是一种由449个氨基酸组成的单链球蛋白，分子大小在50．52kDa。猪胰腺脂肪酶作为一种内源性的脂肪酶，能高效的将甘油三酯水解并释放脂肪酸。在动物机体内，饲粮中脂肪的消化吸收主要依赖于胰腺酶类。脂肪的消化对动物特别对能量要求极高的仔猪具有重要意义，因为仔猪从饲粮中获得的能量有时不能满足自身的需求，需要动用机体沉积的脂肪来满足能量需求。在仔猪断奶期间，胰腺消化酶的激活、分泌和功能尚未发育完善，特别是一些主要分解类的酶如脂肪酶。在幼龄阶段尤其是断奶期间，PPL分泌不足会导致仔猪应激，造成生长停顿或迟缓，造成重大的经济损失。商品的猪胰腺腊肪酶常用

6、于帮助患有胰腺功能紊乱和营养不良的病人，帮助病人消化。但是商品猪胰腺脂肪酶主要来源于动物胰腺提取，在提取过程中会有一些其他酶类的污染。在生产过程中酶蛋白的提取和纯化的高成本、猪胰腺组织资源有限、潜在的微生物疾病污染等因素限制了猪胰腺脂肪酶在饲料工业中的大规模生产应用。因此，有必要开发一种利用基因工程重组技术在酵母表达系统中高效、安全表达具有天然生物学活性猪胰腺脂肪酶的方法。本研究的目的是通过对猪胰腺脂肪酶(PPL)部分基因进行密码子优化，然后在毕赤酵母真核表达系统进行高效表达后，对重组蛋白进行纯化，然后进行酶学活性的分析。首先根据毕赤酵母密码子偏好性，人工设计并合成一段534bp的PPL蛋白

7、N端氨基酸(不含信号肽)编码序列(oPPL)，然后将该片段与剩余天然PPL编码基因序列片段进行连接，获得全长PPL编码序列(rePPL)，将rePPL基因片段克隆到pPICZaA表达载体，构建pPICZaA—rePPL表达载体；将构建好的表达载体转化入毕赤酵母x一33宿主菌中，通过甲醇对转化子进行诱导表达，实现重组蛋白PPL在毕赤酵母真核表达系统中的高效表达。重组外源PPL蛋白c端含有His标签，通过亲和层析(利用NiSepharoseHighPerformance层析柱)对表达蛋白进行纯化，然后对重组蛋白rePPL进行酶学活性分析并与来源于猪胰腺提取的天然商品胰腺脂肪酶PPL(Sigma)

8、进行酶学特性比较。表达纯化后的重组rePPL在12％SDS．PAGE检测显示蛋白质分子量为52kDa，酶学性质分析显示重组PPL与天然商品PPL具有相似的酶学特性，其最适温度为400C，最适pH为8．0，Km值为15．4mg／mL，Vmax为432U／mg。热稳定性结果显示重组PPL不耐热，在60。c保温20rain后，酶活力失去80％(P<0．05)。通过密码优化可以显著提高重组rePPL表达量，与没有密码