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《不同缺失突变的丙型肝炎病毒核心蛋白基因在大肠杆菌中的表达 》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、不同缺失突变的丙型肝炎病毒核心蛋白基因在大肠杆菌中的表达沈才飞，白雪帆，牟丹蕾，黄长形【关键词】丙型肝炎病毒；核心蛋白；突变；原核表达 ExpressionsofdifferentdeletionmutatedHCVcoreproteingenesinE.coli 【Abstract】AIM:ToconstructtherebinantplasmidsexpressingfulllengthHCVcoreproteingeneand3differentdeletionmutatedhepatitiscor
2、eproteingenesandtoexpresstheminE.coli.METHODS:EntireHCVcoreproteingeneand3differentdeletionmutatedgenefragmentsfromHCVcoreproteinplifiedbyPCRandclonedintoexpressionvectorpRSETA,thusformingdifferentrebinantplasmids（pRSETAC573,pRSETAC510,pRSETAC507,pRSETAC444）
3、,edintoE.coliBL21（DE3）pLysSandinducedbyIPTG.SDSPAGEandr约为21×103,19×103,19×103,16.5×103处出现融合表达条带.融合蛋白的表达量约占菌体蛋白总量的20％.结论：全长及3种不同缺失突变的丙型肝炎病毒核心蛋白基因均在大肠杆菌中得到有效表达. 【关键词】丙型肝炎病毒；核心蛋白；突变；原核表达 【中图号】R512.630.27 0引言 丙型肝炎病毒（hepatitisCvirus,HCV）感染已成为全球性的社会公共卫生问题，迄今尚无
4、有效的预防性疫苗.HCV核蛋白基因相对保守〔1〕并且能诱导CTL反应及ADCC，有可能用于开发HCV预防及治疗性疫苗.我室曾扩增羧基末端的20个氨基酸和（或）第60~80位氨基酸多肽基因缺失的核蛋白基因，并在真核细胞中表达成功，初步证实突变掉上诉两个肽断能提高机体免疫反应〔2-3〕.为进一步探讨不同缺失突变核心蛋白对免疫反应的影响，我们构建了HCV核心基因不同缺失突变基因片段的原核表达载体并在大肠杆菌中进行了表达. 1材料和方法 1.1材料 1.1.1质粒与菌株源质粒pCI573,pCI510,pCI50
5、7,pCI444系本室将不同缺失突变的核心蛋白基因克隆入真核表达载体pCIneo中构建而成，其中分别插入了自西安地区患者血清中克隆的1b型HCV完整的核心蛋白基因（573bp）,60～80位氨基酸缺失的核心蛋白基因片段（510bp）,羧基末端20位氨基酸缺失的核心蛋白基因片段（507bp）,同时突变掉60～80位氨基酸和羧基末端20位氨基酸的核心蛋白基因片段（444bp）.原核表达载体pRSETA为Invitrogin公司产品，中间克隆载体pGEMTeasy为Promega公司产品.E.coliJM109由本室
6、保存,BL21为Invitrogin公司产品. 1.1.2工具酶及主要试剂DNA快速提取试剂盒购自上海华瞬生物工程公司、高保真PCR试剂盒、DNA分子量标准、蛋白分子量标准均为大连宝生物工程公司产品，HindⅢ,BamHⅠ,T4DNA连接酶、胶回收试剂盒购自Promega公司.抗His抗体购自Invitrogin公司，二抗及显色试剂购自Sigma公司. 1.2方法 1.2.1PCR引物设计根据源质粒pCI573,pCI510,pCI507,pCI444中HCV核心蛋白基因起始密码子下游及终止密码子上游核苷
7、酸序列设计了3条引物（上海鼎安生物技术有限公司合成）:上游引物P1:5＇GTGCGGATCCATGAGCACGAATCCTAAAC3＇,下游引物：P2:5＇TCGCAAGCTTTCACAAATTTCCCTGTTGTTGCATA3＇,P3:5＇TCGCAAGCTTTCAAGCGGAAGCTGGGGTGGTCAG3＇.在其上游引物引入BamHⅠ酶切位点、下游引物引入HindⅢ酶切位点. 1.2.2目的片段的扩增分别以质粒pCI573,pCI510,pCI507,pCI444为模板进行PCR扩增，扩增过程中模板与引
8、物对应如下：pCI573,pCI510为P1,P2；pCI507,pCI444为P1,P3.循环参数为94℃5min,94℃1min,55℃50s,72℃1min共进行30个循环，最后于72℃延伸10min.取5μLPCR反应液在10g/L的琼脂糖凝胶电泳上进行扩增产物检测分析. 1.2.3重组质粒的构建及鉴定将4种PCR产物按1：3与中间载体pGEMTeasy连接，转化感受态细胞J
