丙型肝炎病毒核心蛋白在鼠肝中表达的诱癌作用

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1、丙型肝炎病毒核心蛋白在鼠肝中表达的诱癌作用【关键词】,丙型肝炎病毒　　【Abstract】AIM:TostudytheexpressioninratliverandcarcinogenesisofhepatitisCviruscoreprotein.METHODS:Therebinantadenoassociatedvirus(rAAV)containingcDNAofHCVcoreproteinonthand9thmonth,SouthernblotassayandDotblotassayRNAofHCVcoreproteinandthetiteroftherAAVrespectivel

2、y.CarcinogenesisofhepatitisCviruscoreproteinonthsafterinfection,alltheresultsofSouthernblotassayandDotblotassayonthafterinfection,partialcellsofSDbandicootstendedtobemalignant.CONCLUSION:TheHCVcoreproteinexpressedintheliverofSDbandicootsisinvolvedincarcinogenesis.　　【Keya,hepatocellular　　【摘要】目的：研究丙

3、型肝炎病毒核心蛋白(HCVcore)在鼠肝中的表达和可能潜在的直接致癌作用.方法：以病毒重组技术制备含HCVCore区cDNA的重组腺伴随病毒载体.重组腺伴随病毒感染大鼠肝脏，感染2,9mo后分别以Southernblot印迹杂交法和Dotblot杂交法检测鼠肝HCVCore区基因的整合、mRNA形成情况及病毒滴度.HE染色观察诱癌实验结果.结果：收获重组病毒滴度为2.41×1014颗粒数（分子数）/L.分别感染2,9mo后检测大鼠肝脏Southernblot印迹杂交结果和HCVcoremRNA均为阳性，HCVcore基因为非定点整合.感染后9mo实验组大鼠部分细胞有恶性倾向.结论：HCV

4、core在大鼠肝中持续表达，初步观察到其致瘤变作用.　　【关键词】丙型肝炎病毒；病毒核心蛋白质类；癌，肝细胞　　0引言　　HCV感染是肝细胞癌主要的病因之一，但其致癌机制仍不清楚.普遍观点认为其具有间接致癌性，我们的研究［1］则表明HCV核心（Core）蛋白可能具有潜在的直接致癌作用.对HCVCore蛋白致癌作用的研究不但能揭示HCV的致病特征，而且对肝癌的预防和治疗具有重要意义.　　1材料和方法　　1．1材料　　腺伴随病毒载体pSSHG由西安交大医学院解剖教研室惠赠，辅助质粒pAAV/Ad由第四军医大学病理学教研室惠赠，含5号腺病毒全部基因组的质粒pFG140由中国预防医学科学院病毒所惠

5、赠.重组质粒pSSHG/HCVCore按文献［1］构建，人胚肾细胞株293细胞和大肠杆菌DH5α由本室提供，SD大鼠,４～6周龄，体质量108～130g，平均(113±2)g,由西安交大医学院动物中心提供.各种工具酶购自Promega公司.　　1．2方法　　重组腺伴随病毒载体质粒pSSHG/HCVCore、辅助质粒pAAV/Ad及质粒pFG140，磷酸钙共沉淀转染法转染293细胞，制备AAV重组病毒原液.透析完全的重组病毒经0.22μm微孔滤膜除菌处理，同样以质粒pFG140转染293细胞观察腺病毒毒性作用.同时制备pSSHG质粒的重组腺伴随病毒作为阴性对照.采用Dotblot杂交法检测重

6、组病毒颗粒数的总量.取20只4～6周龄SD雄性大鼠，体质量(113±2)g,切除40%肝左叶，于肝中叶深部直接注入含HCVCore区基因重组腺伴随病毒20μL；另取20只4～6周龄SD雄性大鼠为对照组，于肝中叶注入不含HCVCore区基因的重组腺伴随病毒(pSSHG).饮水中加600mL/L食用乙醇，平均每只0.2mL/d饮养.重组腺伴随病毒感染鼠肝后2mo及9mo，分别剖杀实验组、对照组大鼠，取0.5cm3中叶部分肝组织，提取肝细胞基因组大分子DNA，纯化酶切后行Southernblot印迹杂交.异硫氰酸胍法提取肝细胞总RNA.HCVCore探针行斑点杂交法检测HCVCoremRNA.取

7、1.5cm×1.5cm×0.5cm大小肝脏组织块，浸入100g/L甲醛液固定过夜；流水冲洗24h以减少甲醛影响；逐级脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋；制成0.4cm组织切片，行常规HE染色；常规脱蜡，染色，脱水，透明，封固；镜下观察肝细胞情况.　　2结果　　2．1重组腺伴随病毒的制备及病毒滴度制成AAV重组病毒原液，在72h内实验组细胞未见明显腺病毒毒性作用.同时制备pSSHG质粒的重组腺伴随病毒作为阴性对照.采用Dotbl