丙型肝炎病毒核心蛋白与其结合蛋白hcbp12在hepg2细胞中的相互作用

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1、丙型肝炎病毒核心蛋白与其结合蛋白HCBP12在HepG2细胞中的相互作用【关键词】肝炎病毒病毒核心蛋白质类HCBP12哺乳动物双杂交系统基因报告0引言丙型肝炎病毒（hepatitisCvirus，HCV）核心区位于HCV基因组的342～914nt，其编码的核心蛋白由191个氨基酸组成，是最保守的HCV蛋白.核心蛋白除了作为核壳蛋白具有病毒颗粒组装功能外，还具有调节细胞凋亡、脂代谢、转录、免疫呈递等作用［1］，临床和实验研究显示核心蛋白具有广泛的反式激活作用，与宿主蛋白相互作用，可能是病毒感染导致肝细胞损伤和肝细胞癌发生、发展的重要原因［2-3］.我们以往应用酵母双杂交系统，以HCV

2、核心蛋白为诱饵蛋白，在肝文库中筛选到HCV核心蛋白的相互作用蛋白，并命名为HCBP12，用免疫共沉淀技术证明HCV核心蛋白和HCBP12可以相互结合［4］，但是酵母双杂交系统和免疫共沉淀技术在验证蛋白质相互作用上都有一定的局限性［5］.为研究HCBP12的功能，我们应用哺乳动物双杂交系统模拟真核动物体内环境，进一步证实HCV核心蛋白与HCBP12在HepG2细胞系中有相互作用，为研究HCBP12和HCV核心蛋白的功能奠定基础.1材料和方法1.1材料CheckMateTMMammalianT，PureYieldTMPlasmidMidiprepSystem，DualLucifera

3、seReporterAssaySystem（美国Promega公司）；克隆有HCV核心蛋白cDNA的质粒3.1HCVcore，32aHCBP12由本室保存；PCRTaq酶（北京鼎国生物有限责任公司）；DNA重组所用的各种限制性内切酶、T4DNA连接酶（大连宝生物公司）；玻璃奶DNA凝胶回收试剂盒，Lipofectamine2000（Invitrogen公司）；测序由上海生工公司完成，HepG2细胞本室；TurnerBioSystemsVeritasMicroplateLuminometer（购自美国BIO公司）.1.2方法1.2.1用PCR扩增HCV核心蛋白(core)和HCB

4、P12基因分别根据core基因和其最终载体PBIND的序列,设计克隆编码核心蛋白基因的引物为下游P1：5′gATATCggTgAAgCgggCACA3′；上游引物P2：5′gATATCTTAggATgCCATgCCAAgCAg3′；以质粒3.1HCVcore为模板，PCR反应条件为：94℃30s，65℃30s，72℃40s，35个循环;HCBP12基因和其最终载体PACT,克隆编码HCBP12蛋白基因的引物为上游P1：5′gTCgACTTATggTTgAgcTCATgTTCC3′；下游引物P2：5′gATATCTTAgTCTATTgggAggCCCAgC3′；以3

5、2aHCBP12为模板，PCR反应条件为：94℃30s，65℃30s，72℃60s，35个循环.1.2.2PCR产物克隆及鉴定将纯化回收的目的core及HCBP12基因片段分别与pGEMT载体在16℃条件下用T4DNA连接酶连接过夜，转化入大肠埃希菌DH5α感受态细胞，铺于含有氨苄青霉素的LB平板，37℃孵育16h.挑取白色菌落行菌落PCR，碱裂解法提取阳性克隆质粒，分别命名为pGEMTcore及pGEMTHCBP12，分别进行BamHⅠ/EcoRⅤ和SalI/EcoRⅤ双酶切鉴定.证明目的基因片段已插入pGEMT载体中后送生物公司测序进行分析.测序显示正确后用BamHⅠ

6、/EcoRⅤ从pGEMTcore克隆质粒上酶切目的基因片段core，用SalI/EcoRⅤ从pGEMTHCBP12质粒上酶切目的基因片段HCBP12,10g/L琼脂糖凝胶电泳纯化回收目的片段.1.2.3构建及鉴定真核表达载体用BamHⅠ/EcoRⅤ双酶切表达载体PBIND，SalI/EcoRⅤ双酶切PACT，回收双酶切产物PBIND和PACT，载体片段与已经回收的要插入的插入片段core和HCBP12连接后转化大肠埃希菌DH5α，铺于含有氨苄青霉素的LB平板上37℃孵育18h.挑取白色菌落行菌落PCR，碱裂解法提取阳性克隆质粒，分别命名为PBINDcore及PACTHCBP

7、12，并分别用进行BamHⅠ/EcoRⅤ和SalI/EcoRⅤ双酶切鉴定,证明目的基因片段已插入真核表达载体中后,送生物公司测序进行分析.测序正确后，应用转染级质粒提取试剂盒PureYieldTMPlasmidMidiprepSystem进行大规模的质粒提取和纯化.1.2.4转染HepG2细胞按双杂交系统说明于转染前1d设计转染的样本，同时设阴性和阳性对照组.共转染6组细胞，每组3个复孔，于24孔板培养平板的18孔每孔加500μL不含双抗（氨苄和庆大霉素）的DMEM培