hepg2在细胞中rorγ相互作用蛋白的筛选及功能研究

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1、第三军医大学博士学位论文HepG2在细胞中RORγ相互作用蛋白的筛选及功能研究姓名：黄泽民申请学位级别：博士专业：免疫学指导教师：吴玉章201205第三军医大学博士学位论文HepG2细胞中ROR?相互作用蛋白的筛选及功能研究摘要研究背景和目的维甲酸相关孤儿核受体(Theretinoid—relatedorphannuclearreeeptorgamma，ROR?)高表达于肝脏、脂肪组织、骨骼肌以及胸腺中，并在发育、免疫和代谢中起着重要的调节作用。已有研究表明，细胞功能都是几个蛋白质分子协同作用于生物大分子组装过程和信号通路上的结果。蛋白质复合物

2、是高度规律的动态的结构，该结构能将生物信息转变为细胞的各种生物学功能。蛋白质复合物的组成随着时间空间不断变化，以适应胞内不断变化的复杂需求，因此蛋白复合物组成的分析被认为是整合基因型到表型过程中一个很重要的步骤。转录因子通常会形成蛋白复合体行使转录下游基因的功能。依据已有的研究我们推断，作为胞内重要的转录因子ROR?蛋白也应该有它的相互作用蛋白伙伴共同形成一个功能性的蛋白复合物，进而调节下游的生物学过程。尽管已有报道发现存在几个ROR7相互作用蛋白质，但这些鉴定出来的蛋白质都不是在同一个实验里被发现的，提示上述研究所使用方法均存在一定缺陷，同时

3、提示我们，如使用更合适的方法全面地捕获RORv相互作用蛋白可能有新的发现。近年来，已开发出串联亲和纯化(thetandemaffinitypurification，TAP)方法用于蛋白复合物的分离研究吗，该方法最初是串联两个亲和纯化步骤用来在酵母中捕获蛋白复合物，现已改良为基于蛋白G和卵亲和素的串联标签(tandemtagsbasedonproteinGandthestreptavidin-bindingpeptide，GS．TAP)以获得更多的纯化产物。因此，为进一步研究ROR?相互作用蛋白质，尤其在ROR?参与的基因转录调控的蛋白质复合物水

4、平，我们使用改良TAP方法来捕获内源性ROR?蛋白质复合物，并在稳定转染的HepG2细胞中深入解析这些相互作用的蛋白质。实验方法1．从HepG2细胞中克隆ROR7基因从HepG2细胞中提取总RNA并逆转录成eDNA，并用该eDNA作为扩增ROR?基因的模板。同时，用RORy特异性的引物，PCR条件参数设置为：98"C15see，68℃10sec，72℃90sec，30循环。产物亚克隆入质粒pMD@19．Tvector中，然后通过限制性10第三军医大学博士学位论文内切酶眈积，和Hind111进行酶切初步鉴定，并送生物公司作进一步测序鉴定。2．构建

5、pCeMMRORT-CTAP(SG)质粒载体通过末端带有限制性内切酶基因序列的特异引物，从质粒载体pMD@19．TRORv中用PCR方法扩增出RORTDNA片段。随后，将扩增的产物通过EcoR1和PmeI内切酶位点克隆入质粒pCeMMCTAP(SG)中，并得到融合表达RORv—CTAP(SG)片段的质粒pCeMMRORT-CTAP(SG)。为了获得能够用抗生素筛选的稳定转染细胞系，再通过Xho1和EcoR1位点将RORT-CTAP(SG)和CTAP(SG)片段亚克隆入含嘌呤霉素抗性基因的载体质粒pMSCVpuro中，构建得到pMSCVpuroR

6、ORy．CTAP(SG)和pMSCVpuroCTAP(SG)质粒。而且，以上构建的这些所有质粒载体均通过了测序鉴定。3．细胞培养，RNA干扰和转染HepG2细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM完全培养基中。通过英俊生物公司设计并合成靶向干扰ROR7、RIPl40和HSP90基因编码区的小分子干扰RNA(siRNA)片段，并将这些siRNA和先前构建的表达载体，按照试剂说明书方法用LipofectamineTM2000转染进HepG2细胞中。对于瞬时转染，24hr后胰酶消化收集细胞。为获得稳定转染细胞株，细胞转染36hr后在完全培养基中添加1．5

7、_tg／mL浓度的嘌呤霉素进行培养，并在随后的每2～3天更换一次含抗生素的完全培养基。4．蛋白印迹实验等量的蛋白样品按实验设计要求加入到4．12％梯度预制胶上样孔中进行电泳，直至靶蛋白电泳分离到最适检测的范围时停止电泳，随后将凝胶中分离的蛋白条带转印至PVDF膜上。经过封闭，将膜上蛋白置于含合适浓度的RORy、SBP、proteinG、RIPl4、RFXDCl、HSP90、ZNF21、DOC2、Sp5、EMGl或Tubulin抗体中进行孵育，PBS洗去非特异结合的抗体后，再用最适浓度的HRP标记的二抗室温孵育lhr，在洗掉非特异结合的二抗后，按

8、说明书要求配置并孵上适量的HRP底物到蛋白条带上，最后通过显影定影获得抗体特异的目标蛋白条带。5．细胞免疫荧光染色稳定转染pMSCVpuroRORy-