lrp16相互作用蛋白的筛选及功能调控研究

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1、中国人民解放军军医进修学院;中国人民解放军总医院硕士学位论文LRP16相互作用蛋白的筛选及功能调控研究姓名：杨（丰刀女）申请学位级别：硕士专业：病理与病理生理学指导教师：赵亚力;韩为东20080520军医进修学院硕士学位论文LRPl6相互作用蛋白的筛选及功能调控研究中文摘要中又摘要目的：①应用酵母双杂交技术筛选人乳腺癌细胞MCF．7eDNA文库中可与LRPl6相互作用的蛋白；②确认LRPl6与AR等核受体及NF．KB的相互作用；③研究LRPl6对AR转录活性的调控作用及其对前列腺癌细胞系LNCap在不同浓度雄激素刺激下增殖的影响；④观察雄激素对LRPl6表达的调控

2、作用。方法：OpLPC．LRPl6质粒经酶切、琼脂糖凝胶电泳、回收，获得LRPl6的基因片段，将其连接至酵母双杂交系统诱饵载体pGBKT7中，经酶切验证其正确插入方向后，将重组诱饵质粒转化酵母菌AHl09和Y187，并检测其在酵母中有无自激活作用和毒性。随后提取转化后的酵母总蛋白，经Westemblot检测诱饵质粒在酵母中的表达情况，以鉴定其作为诱饵蛋白的可行性。②将诱饵质粒pGBKT7．LRPl6、MCF一7dseDNA文库片段及线性化质粒pGADT7．Ree共转化酵母菌AHl09，在营养缺陷型培养基(SD／．Leu／．Trp／．His／．Ade)上筛选阳性茵落

3、。提取阳性克隆质粒进行PCR，将PCR产物测序，并将酵母质粒转化感受态大肠杆菌Topl0获得与诱饵质粒有相互作用的单个文库质粒，测序后回复验证其在酵母中的相互作用。③用免疫共沉淀(Co．IP)及GSTpull．down等体内、体外的方法验证LRPl6与ART-27的相互作用；进一步采用GSTpull—down确认LRPl6与AR等核受体及NF．KB直接的相互作用，并验证了LRPl6与AR相互作用的结构域；④荧光素酶报告基因检测LRPl6对AR转录激活的影响及AR对LRPl6启动子的调控作用；⑤采用MTT检测抑制内源性LRPl6在不同雄激素浓度刺激下对LNCap增殖

4、的影响；⑥在不同浓度及不同作用时间点睾酮刺激下，用Westernblot检测LRPl6蛋白表达水平的变化及在不同前列腺癌细胞系LRPl6的表达情况。结果-①重组诱饵质粒经酶切验证，片段大小和插入方向均正确，将其转化入酵母菌后无自激活作用和毒性，Westernblot证实在酵母中重组诱饵质粒可正确表达人LRPl6蛋白；②获得8个与LRPl6相互作用的候选蛋军医进修学院硕十学位论文白，选取4个在酵母中进行回复验证，其中有3个可生长出阳性克隆；③ART-27可与LRPl6相互作用，且AR、EP-13、PPAR0【、PPAR丫等核受体及NF—KB均与LRPl6有直接的相互

5、作用；④LRPl6通过唯一的C端结构域与AR的LBD域相互作用；⑤在睾酮的作用下，过表达LRPl6对AR的转录活性有增强作用，抑制内源性LRPl6的表达可减弱AR的转录激活活性：⑥减少内源性LRPl6表达可抑制不同雄激素水平下LNCap细胞的增殖；⑦低浓度的睾酮可使LRPl6蛋白表达增多，睾酮作用3h即可使LRPl6蛋白表达增多，且AR对LRPl6启动子活性存在增强作用；⑧AR阳性的前列腺癌细胞系LNCap比AR阴性的前列腺癌细胞系DUl45中LRPl6蛋白含量．-而。结论：①应用酵母双杂交技术筛选出一族功能基本明确的可与LRPl6相互作用的候选蛋白；②LRPl6

6、可与AR、NF．KB直接相互作用，且这种相互作用不依赖于ART-27的存在；③LRPl6是部分核受体家族相互作用的蛋白因子；④雄激素反应性靶基因LRPl6反馈增强AR的转录激活活性，是AR的共激活因子；⑤LRPl6可能通过与AR相互作用调控雄激素敏感性前列腺癌细胞的生长。关键词：LRPl6；蛋白质相互作用；酵母双杂交技术；雄激素受体；共激活因子：增殖2军医进修学院硕}j学位论文ScreeningoftheLRPI6InteractingProteinsandtheSubsequentFunctionRegulationAbstractObjectives：①Tos

7、creenLRP16interactionproteinsfromcDNAlibraryofMCF一7humanbreastcancercelllinebyyeasttwo-hybridtechnology；②ToconfirmtheinteractionofLRP16withnuclearreceptorsandNF-KB：③TostudytheregulationofLRP16onandrogenreceptor(AR)transactivationandtheeffectsofLRP16ontheproliferationofprostatecancerce

8、lllin