弓形虫棒状体蛋白的表达及相互作用蛋白的筛选

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1、密级论文编号:中囯农业科学院学位论文弓形虫棒状体蛋白的表达及相互作用蛋白的筛选ExpressionofToxoplasmagondiiRopsandScreeningoftheHostInteractingProteins硕士研宄生：徐健指导教师：贾洪林副研宄员申请学位类别：兽医硕士专业领域名称：兽医培养单位：哈尔滨兽医研宄所研究生院提交日期：2015年4月独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研究成果：尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他

2、人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研宄生签名:时间AS年妙日关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以釆用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：循

3、时间孓年曰导师签名：爱济沐时间2〇/r年遇汩中国农业科学院硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表密级：论文编号：中国农业科学院学位论文弓形虫棒状体蛋白的表达及相互作用蛋白的筛选ExpressionofToxoplasmagondiiRopsandScreeningoftheHostInteractingProteins硕士研究生：徐健指导教师：贾洪林副研究员申请学位类别：兽医硕士专业领域名称：兽医培养单位：哈尔滨兽医研究所研究生院提交日期：2015年4月Secrecy：No.ChineseAcadem

4、yofAgriculturalSciencesDissertationExpressionofToxoplasmagondiiRopsandScreeningoftheHostInteractingProteinsM.S.Candidate:XuJianSupervisor:JiaHonglinDegree：MasterofAgriculturalExtensionSpecialty:VeterinaryMicrobiologyanditsMolecularbiologyApr2015摘要弓形虫病是

5、由刚地弓形虫引起的一种人兽共患寄生虫病,刚地弓形虫隶属于顶复门，可寄生在除红细胞外几乎所有有核细胞中。据估计，全世界约三分之一的人群感染弓形虫。随着城市的发展、宠物饲养队伍不断地扩大，弓形虫感染的危险性有上升趋势。棒状体蛋白是弓形虫分泌至宿主细胞的主要效应因子，棒状体蛋白定位于宿主细胞的不同部位，与宿主细胞之间存在着复杂的相互作用。该类蛋白可以通过调控膜系及骨架结构，影响宿主细胞的生物活性因子，从而阻断其内在的防御机制，使弓形虫成功的完成入侵，寄生及增殖等一系列生理过程。弓形虫棒状体蛋白Rop28、

6、Rop38在速殖子阶段和缓殖子阶段的表达存在很大差异。本研究通过反转录PCR成功扩增了弓形虫Rop28、Rop38全长基因，将扩增的基因分别克隆至原核表达载体中，成功在大肠杆菌内进行了大量表达，制备了特异性的Rop28、Rop38多克隆抗体。同时，为鉴定与Rop和Rop38相互作用的蛋白分子，构建了Rop28和Rop38真核表达载体，在293T细胞中成功进行了表达。本研究构建了人源成纤维细胞（HFF）和T细胞（CEM）cDNA文库，文库的滴度分别为，1.2×108cfu/ml和1.38×108cfu

7、/ml。利用构建的酵母诱饵质粒筛选HFF文库，获得了与Rop2B、Rop5、Rop16、Rop17、Rop32和Rop38相互作用的宿主细胞蛋白。同时，用Rop38筛选了T细胞cDNA文库。结果显示Rop蛋白与宿主细胞存在着广泛的相互作用。进一步杂交实验证实了Rop2B和7种宿主蛋白存在相互作用；Rop5和7种蛋白存在相互作用；Rop16和14种蛋白存在相互作用；Rop17和7种蛋白存在相互作用；Rop32和12种宿主蛋白相互作用；Rop38和HFF文库中11种宿主蛋白存在相互作用，与CEM文库中2

8、0种蛋白存在相互作用。有文献表明，过量表达Rop38能够显著抑制感染细胞的转录应答。本研究利用Rop38在HFF细胞文库和CEM文库均筛选到PRMT7。PRMT7是一种精氨酸甲基转移酶，是PRMTs家族的重要成员，目前已发现其参与调控基因表达、细胞迁移与分化个体发育等多个过程。Rop38对宿主细胞基因表达的调控很有可能是通过PRMT7通路实现的。本项目旨在通过筛选与弓形虫棒状体蛋白相互作用的宿主蛋白，更深入的进行弓形虫病原性以及宿主相互作用的分子机制的研究，为开发抗弓