刚地弓形虫棒状体rop18基因的克隆、表达及rop18蛋白抗感染免疫保护力的研究

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1、分类号：单位代码：10092密级：学号：20101029刚地弓形虫棒状体ROP18基因的克隆、表达及ROP18蛋白抗感染免疫保护力的研究单位：专业：研究生姓名：导师姓名及职称：研究起止日期：提交日期：河北北方学院医学检验学院病原生物学张颖张进顺教授2012．4．2013．42013．5一嗍河北北方学院学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师(或指导小组)的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获的研究成果，其知识产权归河北北方学院所有。河北北方学院有权对本学位论文进行交流、公开和使用。导师签名：乡协。畅／

2、v研究生签名：喜救饔1k2013年5月30日河北北方学院研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。导师签名：多陬偿研究生虢认瓴2013年5月30日目录中文摘要⋯⋯‰⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．4英文缩写⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．7研究论文弓形虫棒状体

3、ROPl8基因的克隆、表达及ROPl8蛋白抗感染免疫保护力的研究前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．99日lJ舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯26附表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯33j时论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯43结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

4、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯48参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯．．49综述弓形虫棒状蛋白家族的最新研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．55致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．66个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．68中文摘要弓刚地形虫棒状体ROPl8基因的克隆、表达及ROPl8蛋白抗感染免疫保护力的研究摘要刚地弓形虫(ToxoplasmagondiO是重要的机会性致病原虫，广泛寄生于人体及动物的组织细胞内，引起人兽共患病。据美国华盛顿大学医学院的流行病学家调

5、查研究估计，人类每四个人中就有一人感染弓形虫，但通常只有免疫功能低的人才会因为感染弓形虫而表现出临床症状。免疫系统正常的人也有可能因此患上严重的眼部疾病或中枢神经系统疾病，女性可造成所怀胎儿的先天性缺陷或死亡。随着分子生物学技术在寄生虫学研究领域的应用和发展，弓形虫疫苗从最早的全虫疫苗到新近迅速发展起来的核酸疫苗均取得了很大进展。但是弓形虫灭活疫苗免疫保护力低，减毒活疫苗有恢复毒力的风险，不能用于人体，而基因工程多肽疫苗的制备费用高、抗原性弱、制备过程复杂，因此，研制一款安全、有效的抗弓形虫疫苗对于保护易感人群以及促

6、进人类优生优育具有重要意义。弓形虫的顶端复合体在虫体侵入宿主细胞过程中起着重要的作用，其中对棒状体的研究较为广泛、深入。作为棒状体蛋白家族成员之一的ROPl8被认为是目前发现的最有可能与弓形虫入侵人体并在宿主细胞内存活、大量繁殖有关的影响因子。因此，本文以刚地弓形虫RH株棒状体蛋白ROPl8为研究对象，探讨其是否具有抗原性及免疫保护作用。首先提取刚地弓形虫Im株基因坌RDNA，通过PCR扩增棒状体蛋白18(TgROPl8)基因。扩增产物经双酶切后连接到原核表达载体pET30a(+)，建立重组表达载'体pET30a(+

7、)．TgROPl8，将重组质粒转化大肠埃希菌E．coliBL21(DE3)，阳性菌落加入异丙基-13一D硫代半乳糖苷(口TG)诱导表达。用十二烷基磺酸钠．聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS．PAG)分析重组蛋TgROPl8的表达情况，同时以鼠抗弓形虫血清为一抗，蛋白质印迹(Westemblotting)分析该重组蛋白的免疫反应性。1中文摘要实验结果显示，PCR扩增获得TgROPl8基因，长约1665bp，编码554个氨基酸，其中前47个氨基酸构成信号肽序列。菌落PCR、双酶切和测序结果进一步验证重组质粒ET30a(+)．Tg

8、ROPl8构建成功。SDS．PAGE实验证实，经IPTG诱导可获得相对分子质量(必)为59800的可溶性重组蛋!刍TgROPl8。最终经Westernblotting分析，该重组蛋白可被鼠抗刚地弓形虫的血清识别。确定融合蛋白His．ROPl8成功表达后，诱导小鼠抗攻击感染实验。将60只5～6周龄的雌性Balb／c小鼠，体重(18～20)g左右，