弓形虫lamp检测方法的建立与rop18的免疫保护作用

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1、分类号：单位代码：10364密级：学号：s10090602592安徽农业大学学位论文弓形虫LAMP检测方法的建立与ROP18的免疫保护作用DevelopmentofLAMPfortheDetectionofToxoplasmagondiiandImmunoprotectiveEffectofROP18研究生：袁恒青指导教师：李培英教授合作指导教师：徐前明副教授申请学位门类级别：农学硕士专业名称：预防兽医学研究方向：兽医寄生虫与寄生虫病学所在学院：动物科技学院答辩委员会主席：二零一三年五月独创性声明本人声明所呈的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中

2、特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文件，允许论文被查阅和借阅。本人授权安徽农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，收录到《中国学位论文全文数据库》，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，向社会公众

3、提供信息服务。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）。学位论文作者签名：指导教师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日学位论文作者毕业后去向：工作单位：电话：摘要弓形虫病（Toxoplasmosis）是由刚地弓形虫（Toxoplasmagondii）寄生于人和多种动物有核细胞内所引起的人兽共患原虫病，该病广泛流行于世界各地。弓形虫不仅对人类健康构成严重威胁，还给畜牧业生产造成严重经济损失。目前，弓形虫病的诊断主要采取病原学和免疫学方法，但病原学方法检出率低，免疫学方法敏感性、特异性尚不够理想。因此，建立敏感性高、特异性强、且操作简便的弓形虫快速诊断方法对于弓形虫病的防控具有重要意义。鉴

4、于弓形虫病的治疗目前主要依赖磺胺类药物，其耐药性的产生及药物残留对人体健康的危害日益受到关注，对弓形虫虫体蛋白的免疫保护力进行研究，可为研制弓形虫疫苗筛选候选抗原提供依据，弓形虫棒状体蛋白18（ROP18）已被证实是一种重要的毒力因子，参与弓形虫入侵宿主细胞且介导弓形虫的免疫逃避，已有学者对弓形虫ROP18蛋白进行克隆表达和反应原性分析，但是目前关于其免疫保护力的研究报道相对较少。本研究首先通过对安徽猪源弓形虫529bp基因序列进行PCR扩增、克隆、测序和分析，获得保守区域；接着运用环介导等温扩增（LAMP）在线引物设计软件PrimerExplorer4.0设计LAMP扩增引物，并使用

5、Oligo6.0和PrimerPremier5软件进行综合分析和筛选；然后以pMD-19T-529bp重组质粒为模板，建立LAMP扩增反应，并对扩增反应体系和条件进行优化；最后对所建立LAMP方法的敏感性和特异性进行评定，并与PCR方法相比较。结果：扩增出安徽猪源弓形虫529bp基因序列，发现其主要突变区域在第31～74位和第100～141位碱基；设计出一套弓形虫529bp基因LAMP扩增引物；建立了弓形虫LAMP检测方法，经过优化确定了该方法的最佳反应体系和反应条件，且通过添加环引物使得反应时间缩短为33min，该检测方法与超纯水，猪、隐孢子虫、球虫基因组DNA无交叉反应，特异性较好

6、；敏感性较高，达31.0×10copies/mL，是PCR方法的10倍。本研究还对弓形虫RH株的ROP18基因进行了PCR扩增、克隆和测序鉴定，然后分别构建了弓形虫ROP18原核表达质粒pET-32a-ROP18和真核表达质粒pcDNA3.1-ROP18-Flag，并分别在E.coilRosseta和BHK-21细胞中进行表达；原核表达产物进行SDS-PAGE电泳鉴定，并对诱导条件进行优化和重组蛋白的表达形式进行分析；运用Ni-NTA柱对表达产物进行纯化；经Western-blot检测重组蛋白的反应原性；分别采用间接免疫荧光试验和Western-blot进行真核表达产物和产物的反应原性

7、鉴定；分别使用重组质粒和经佐剂乳化的重组蛋白免疫昆明小白鼠，同时设立空白对照组和PBS对照组，并于3免后运用间接ELISA法测定小白鼠血清中抗弓形虫抗体效价；3免后10d对小白鼠进行攻虫试验：腹腔接种3000个弓形虫速殖子，观察I小鼠存活时间，从而研究ROP18对小白鼠的抗弓形虫免疫保护力。结果：构建了原核表达质粒pET-32a-ROP18和真核表达质粒pcDNA3.1-ROP18-Flag；原核表达质粒在E.coilRosseta中以包涵体形