猫弓形虫抗体elisa检测方法的建立与评价

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1、分类号：Q958.9单位代码：10193密级：公开学号：2012076硕士学位论文猫弓形虫抗体ELISA检测方法的建立与评价EstablishmentandevaluationofELISAfordetectioofanti-Toxoplasmagondiiantibodiesincats作者姓名：蔡玉峰学位类别：学术型硕士专业名称：生物物理学研究方向：感染与免疫分子基础指导教师：魏峰教授所在学院：生命科学学院2015年05月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体

2、已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论

3、文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日摘要弓形虫病(Toxoplasmosis)由刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)感染引起，是一种可导致人及动物流产、畸形或死胎的人兽共患寄生虫病，严重危害公共卫生安全和畜牧业生产。猫是其终末宿主，在弓形虫的传播过程中起重要作用。因此，建立

4、快速、准确的弓形虫检测方法对人类健康具有重大意义。弓形虫致密颗粒蛋白(GRAs)是一类分泌排泄蛋白，其中GRA1与弓形虫速殖子侵染宿主细胞的信号转导有关，而GRA7在弓形虫各个时期均能分泌，是一种潜在的疫苗侯选分子。证明GRA1、GRA7作为诊断抗原具有良好的免疫原性，可作为血清学诊断弓形虫病的基因标志物。本研究利用原核表达的弓形虫致密颗粒蛋白GRA1、GRA7，建立了GRA1-ELISA与GRA7-ELISA检测方法。利用构建原核表达载体pET-28a-GRA1、pET-28a-GRA7，转化大肠杆菌，IPTG诱导表达，经SDS-PAGE验证，重组蛋白GRA1与GRA7分子量分别

5、为25、27kDa；Westernblotting分析表达产物，结果表明，该产物具有较强的免疫反应；应用Ni-NTA对表达蛋白进行纯化，蛋白纯度高达98%；GRA1与GRA7的浓度分别为200μg/mL和600μg/mL。利用纯化重组蛋白GRA1和GRA7分别作为诊断抗原，建立GRA1-ELISA和GRA7-ELISA检测方法。确立了GRA1、GRA7最佳抗原包被浓度5μg/mL、5μg/mL，血清一抗最佳稀释度1:64，HRP标记兔抗猫IgG二抗最佳工作浓度1:20000。试验表明GRA1-ELISA与GRA7-ELISA方法检测灵敏度高，重复性好。应用GRA1-ELISA和GR

6、A7-ELISA方法检测旋毛虫、包虫、猪附红细胞体和猫弓形虫阳性血清，表明建立的GRA1-ELISA与GRA7-ELISA检测方法具有特异性。建立GRA1-ELISA和GRA7-ELISA检测方法以MAT/IFA法检测结果为标准进行比较评价，GRA1-ELISA检测方法假阳性率为10.8%，假阴性率为4.1%，而GRA7-ELISA检测方法假阳性率为7.5%，假阴性率为1.4%，说明GRA7为诊断抗原检测弓形虫病的假阳性率和假阴性率较低。将差异部分通过McNemar卡方检验均无显著性差异(P>0.05)；将一致部分通过Kappa检验，GRA1：Kappa=0.83，结果一致率为94

7、.6%；GRA7：Kappa=0.92，结果一致率为97.2%；表明GRA7-ELISA检测方法一致率较高。ROC曲线分析出建立的GRA7-ELISA稳定性较好。GRA1-ELISA的cut-off值为0.11时，敏感性为83.6%，特异性为87%；GRA7-ELISA的cut-off值为0.26时，敏感性为89.7，特异性为92.5%。试验表明GRA1作为诊断抗原建立GRA1-ELISA方法检测效果不明显，敏感性与特异性较低、稳定性较弱；GRA7为检测猫弓形虫病的优