新城疫病毒抗体ELISA检测方法的建立与应用.pdf

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1、动物医学进展。2012，33(12)：126—129ProgressinVeterinaryMedicine新城疫病毒抗体ELISA检测方法的建立与应用索南元旦(青海省玉树州畜牧兽医工作站，青海玉树8150O0)摘要：为建立一种快速的新城疫病毒抗体检测方法，本研究以原核表达的重组HN蛋白作为诊断抗原，建立了检测新城疫病毒抗体的间接ELISA诊断方法。该方法检测AIV(H9亚型)、IBV、IBDV、EDSV4种常见禽病病原的阳性血清均为阴性；检测灵敏度为1：12800；批内重复性试验、批间重复性试验的变异系数分别小于5和10；与血凝抑制试验(HI)符合率为96．1。本研

2、究建立的NDVHN间接EIISA检测方法具有良好的特异性、敏感,tg和重复性，为NDV的抗体检测及流行病学调查等快速诊断提供一种技术手段。关键词：新城疫病毒；HN蛋白；间接酶联免疫吸附试验中图分类号：$852．659．5文献标识码：A文章编号：10075038(2012)12—0126—04新城疫(Newcastledisease，ND)是由副黏病毒炎病毒(IBV)、鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)、减科(Paramyxoviridae)副黏病毒亚科(Paramyxo—蛋综合征病毒(EDSV)阳性血清及NDV参考阴性、virinae)禽腮腺炎病毒属(Avulaviru

3、s)的新城疫病阳性血清均购自中国兽医药品监察所。检测用血清毒(Newcastlediseasevirus，NDV)引起的禽类高度样品由青海省动物疾病中心实验室收集并保存。接触性、烈性传染病，被世界动物卫生组织(OIE)列1．1．2主要试剂辣根过氧化物酶(HRP)标记的为必须报告的动物传染病，呈世界性分布，每年全球兔抗鸡IgG为Sigma公司产品；TMB底物液购白天因鸡新城疫所造成的直接经济损失达数十亿元，是根生物科技有限公司。危害全球养鸡业的最重要传染病之一Ⅲl]。该病也1．2方法是影响我国养禽业健康发展的重要疫病之一，对我1．2．1包被抗原纯化的新城疫病毒重组HN蛋

4、国禽类产品的食品安全以及人类健康都存在着潜在白经SDS—PAGE分析验证后，采用Bradford法测定危害_6。]。NDV常规的病毒分离技术和分子生物学蛋白浓度，置于一7O℃保存。检测方法存在周期长、操作复杂等缺点，无法满足基1．2．2NDVHN间接ELISA操作程序将纯化层兽医部门大批量样品检测的需要。NDV基因组后的重组HN抗原用碳酸盐缓冲液(CBS)适当稀释全长15186bp，编码6种结构蛋白，其中血凝素一神后，每孔100肚L包被ELISA反应板，置4℃过夜。经氨酸酶糖蛋白(HN)为病毒囊膜蛋白，是病毒复制次日洗涤后，加入适当封闭液，置37℃封闭适当时必需蛋白，

5、为病毒特异性保护性抗原，存在中和B细问。洗涤后，加入适当稀释后的血清样品(一抗)，置胞抗原表位，能够诱导机体产生特异性免疫应答，是37℃作用适当时间。洗涤后，加入适当稀释的辣根NDV诊断试剂研究的常用蛋白l8。。本研究以重过氧化物酶(HRP)标记的兔抗鸡IgG(酶标二抗)，组HN蛋白为包被抗原，建立了一种简单、快速、特置37℃作用适当时间。洗涤后，每孔加入10oI异、敏感新城疫病毒抗体检测方法，为基层兽医部门TMB底物显色液，置37℃作用适当时问。加入新城疫病毒抗体的检测、监测及流行病学调查等提2mol／LHSO终止反应。用酶标仪在波长450供一种有效的检测技术。nm

6、处测定每孑L的吸收值(OD450nm值)。1材料与方法1．2．3NDVHN间接EIISA反应条件的优化1．1材料1．2．3．1抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的1．1．1抗原与血清原核表达的新城疫病毒重组确定采用方阵滴定法，将不同浓度(51．2、25．6、HN蛋白由青海省动物疾病中心实验室制备并保12．8、6．4、3．2、1．6、0．8、0．4~g／mL)重组的HN蛋存。H9亚型禽流感病毒(H9AIV)、传染性支气管白与不同稀释度(1：50、1：100、1：200、1：400)的收稿日期：2012-07—09作者简介：索南元旦(1972)，男，青海称多人，畜牧师，主要

7、从事畜牧兽医．7-作。索南元旦：新城疫病毒抗体ELISA检测方法的建立与应用127一抗组成方阵，保持其他反应条件不变，确定最适合的568份血清样品，统计血清抗体阳性率，同时统计的抗原最佳包被浓度和一抗最佳稀释度。NDVHN间接ELISA方法相对于HI的特异性、敏1．2．3．2酶标抗体最佳稀释度与最佳作用时间的感性及符合率。确定采用方阵滴定法，将不同稀释度(1：2000、2结果1：4000、1：6000、1：8000)的HRP标记的兔抗2．1诊断抗原的制备鸡IgG与酶标抗体不同作用时间(30、60、90、120纯化的重组HN蛋白(图1)经Bradfor