豚鼠弓形虫抗体ELISA检测方法的建立及应用.pdf

豚鼠弓形虫抗体ELISA检测方法的建立及应用.pdf

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1、Aug.2013.33(4)实验动物与比较医学LaboratoryAnimalandComparativeMedicine275doi:10.3969/j.issn.1674—5817.2013.04.006豚鼠弓形虫抗体ELISA检测方法的建立及应用李晓波,付瑞,巩薇,王吉,卫礼,王淑菁,岳秉飞,贺争鸣(中国食品药品检定研究院一实验动物资源研究所,北京100050)[摘要】目的建立以弓形虫重组抗原的豚鼠弓形虫抗体ELISA方法,并进行初步应用。方法根据重组抗原的工作浓度包被酶标板,确定酶标二抗浓度,对方法的特异性、灵敏度、稳定性和重复性等进行测试。结果确定酶

2、标二抗最佳稀释度为1:8000;与豚鼠淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCM)、仙台病毒(sv)、肺炎病毒(PVM)TL呼肠孤3型(Reo3)阳性血清均无交叉反应;对已知阳性血清的检测上限可达1:2560;6个月的稳定性试验显示Ao值的相对偏差均小于15%;批内变异系数(cv)5.7%~9.5%,批间变异系数(CV)I.9%~9.O%;对182份样本的检测表明豚鼠弓形虫抗体阳性率为7.14%(13/182),与IFA检测结果的符合率为100%,与商品化试剂盒的阳性符合率为92-3%,阴性符合率为100%。结论建立的豚鼠弓形虫重组抗原ELISA检测方法可用以弓形虫抗体

3、的常规检测。【关键词]豚鼠;弓形虫;重组抗原;酶联免疫吸附试验【中图分类号】Q95.33【文献标识码]A[文章编号]1674—5817(2013)04.0275—04弓形虫(学名为冈地弓形虫,Toxoplasmagondii),初步应用。球虫目,肉孢子虫科,弓形虫亚科,弓形虫属,是一种全球性人畜共患寄生虫病,为专性细胞内寄1材料与方法生原虫,在实验动物的各种有核细胞中均可寄生和繁殖⋯,不仅危害动物健康,干扰动物实验,还1.1材料弓形虫重组抗原:深圳飞鹏生物技术有限公司可通过实验动物传给饲养和实验人员[2l引,国标中提供(来自从人分离的弓形虫,接种实验小鼠进行将

4、弓形虫列为所有实验动物的必检项目。增殖后提取的核酸);可拆卸酶标板:购自深圳金灿免疫学诊断是弓形虫感染调查与诊断的常用方华公司;羊抗豚鼠IgG—HRP:购自KPL公司;豚鼠弓法,目前常用的诊断技术有免疫荧光法(IFA)、间形虫抗体血清对照,弓形虫抗原片均由本室制备保接血凝法(IHA)及酶联免疫吸附试验(ELISA)等。存Iq:动物弓形虫IgG抗体酶免试剂盒:珠海经济特ELISA敏感特异,操作简便,是诊断弓形虫感染应用最广的技术f41。作者以弓形虫人工重组抗原区海泰生物制药有限公司;待检样本均来自动物生产单位送检血清。代替传统的虫体或虫体成份为诊断抗原,建立了弓

5、形虫抗体的间接ELISA检测方法,并对方法进行了1.2方法1.2.1重组抗原的包被按照产品说明,将弓形虫重组抗原进行1:5000稀释包被酶标板。【收稿日期】2012—11-291.2.2酶标二抗最佳工作浓度的确定豚鼠弓形虫【基金项目】国家科技支撑计划(编号:2011BAI15B01)抗体阳性和阴性血清1:40稀释(GB/T14926.50.【作者简介]李晓波(1980一),男,硕士,研究方向:实验动物免2001),羊抗豚鼠IgG—HRP按1:1000~1:8000倍疫学。E—mail:lxb8493059@yahoo.com.cn【通讯作者】贺争鸣,研究员,研

6、究方向:实验动物微生物学,比稀释,测定A4o的吸光值来确定二抗的最佳浓度。E—man:zhengminghe57@163.com1.2_3判断标准阴、阳性对照成立的情况下,待276实验动物与比较医学LaboratoryAnimalandComparativeMedicineAug.2013.33(4)检血清孔。值≥0.2,同时待检血清孔9o值/阴2结果性对照孔Ao值≥2.1,判为阳性;否则为阴性【。1.2.4特异性试验用建立的方法检测豚鼠淋巴细2.1酶标二抗最佳工作浓度胞脑膜炎病毒(LCM)、仙台病毒(sv)、肺炎病毒不同浓度的羊抗豚鼠IgG.HRP反应后,测

7、定fPVM)及呼肠孤病毒III型(Reo3)标准阴、阳血清,A49o值,结果在1:8000浓度时P/N值最高,确同时设弓形虫阴、阳对照。定酶标二抗的最佳工作浓度为1:8000。1.2.5灵敏度试验弓形虫抗体阳性血清1:40倍2.2特异性试验比稀释,用最适反应体系进行检测,测定结果为在Tox阴、阳对照成立的条件下,与豚鼠淋阳性的最大稀释比例。巴细胞脑膜炎病毒(LCM)、仙台病毒、肺炎病毒1.2.6稳定性试验将同一批次的抗原板置4℃分(PVM)及呼肠孤病毒III型(Reo3)阴、阳血清均无特别放置0、1、2、4和6个月,检测同样的5份异反应。阳性和5份阴性血清,每

8、份血清重复测3次,计2.3灵敏度试验算

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