弓形虫多表位dna疫苗的构建及其免疫保护作用

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1、弓形虫多表位DNA疫苗的构建及其免疫保护作用【摘要】目的:构建弓形虫多表位DNA疫苗并研究其免疫保护效果。方法:将编码含弓形虫多个T、B细胞表位的6段弓形虫多肽基因,以5个甘氨酸编码基因相间隔相连接,克隆入真核表达质粒pcDNA3.1(＋)中,构建成多表位弓形虫DNA疫苗。免疫BALB/c小鼠,测定其诱导的特异性抗体水平及T淋巴细胞增殖状况,同时进行弓形虫攻击感染保护实验。结果:成功构建了包含多个弓形虫表位的真核表达质粒pcDNA3.1/TME,以其作为DNA疫苗免疫小鼠,可诱导机体产生弓形虫特异性的体液及细胞免疫应答,产生有效的抗弓形虫保护性免

2、疫应答。结论:构建的弓形虫多表位DNA疫苗能诱导机体产生有效的保护性免疫应答,在控制弓形虫感染上具有可行性。【关键词】弓形虫表位DNA疫苗　　刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)引起的弓形虫病(Toxoplasmosis)是一种人兽共患寄生虫病,广泛流行于我国及世界各地,全球感染率高达25%～35%,我国人群感染率为5%～20%。成人感染弓形虫后多呈无症状带虫者,孕妇感染后可造成流产、胎儿畸形以及胎儿死亡等不良妊娠结局,免疫功能受抑制或有免疫缺陷的患者合并弓形虫感染时,可成为患者死亡的主要原因之一［1,2］。近年来,国内外学者在弓形虫疫苗

3、的研究上进行了大量的探索工作,11大致经历了全虫疫苗、虫体特异组分疫苗和核酸疫苗等阶段,但均尚未研制出安全有效疫苗。动物实验发现,弓形虫全虫疫苗、特异抗原组分疫苗有预防弓形虫感染或降低感染程度作用,但前者可能会引起再感染,后者的免疫保护效果较差［3-5］。弓形虫病核酸疫苗有望弥补上述疫苗存在的不足,具有良好的开发应用前景,但目前研究尚处于初始阶段,而且对弓形虫多表位DNA疫苗的研究尚缺乏报道。本研究中我们将编码含弓形虫多个T、B细胞表位的6段弓形虫多肽基因（分别编码SGA1238～256aa、SGA1281～320aa、GRA1170～193aa、

4、GRA4331～345aa、GRA4229～245aa和GRA2171～185aa）,以5个甘氨酸编码基因相间隔进行连接,克隆入真核表达质粒pcDNA3.1中,构建成多表位弓形虫DNA疫苗,以期获得更好的免疫保护效果,为构建安全有效的多表位弓形虫DNA疫苗提供理论和实践基础。　　1材料和方法　　1.1材料质粒pcDNA3.1(+)、大肠杆菌DH5α及弓形虫RH国际标准株均为本室保存。核酸内切酶EcoRI、BamHI,T4连接酶购自美国MBI公司。胎牛血清购自天津正江生物公司。兔抗小鼠IgGHRP购自博士德公司。TMB为美国Sigma公司产品。RP

5、MI1640为美国Gibico公司产品。MTT（四甲基偶氮唑盐）为美国Amresco公司产品。96孔细胞培养板购自丹麦Costor公司。BALB/c及ICR小鼠购于西安交通大学实验动物中心。11　　1.2方法　　1.2.1真核表达载体pcDNA3.1/TME的构建目的基因片段,包含编码弓形虫SGA1238～256aa、SGA1281～320aa、GRA1170～193aa、GRA4331～345aa、GRA4229～245aa和GRA2171～185aa6个多肽片段的基因（GenBankS76248,M26007,M76432,L01753）,每

6、片段间以5个甘氨酸编码基因相间隔进行连接,并在5'端添加了BamHI酶切位点和ATG启动密码子,3′端添加了TAA终止密码子和EcoRI酶切位点,共483bp,由上海生工生物工程技术有限公司合成。按常规方法将该目的基因插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)BamHI和EcoRI酶切位点之间,转化大肠杆菌DH5α,重组质粒经DNA测序鉴定无误后,命名为pcDNA3.1/TME。　　1.2.2质粒的大剂量提取及纯化碱裂解法分别大剂量提取重组质粒pcDNA3.1/TME和空质粒pcDNA3.1,并用聚乙二醇沉淀法纯化后,经紫外分光光度计定量,溶于灭菌

7、去离子水中,浓度均为1g/L。　　1.2.3动物免疫SPF级雌性6周龄BALB/c小鼠32只,随机分为两组,即注射pcDNA3.1空质粒的对照组和注射重组质粒pcDNA3.1/TME的实验组,每组16只。每只小鼠均先用2.5mL/L盐酸布比卡因50μL分别注射小鼠双侧胫前肌进行预处理,311d后在小鼠双侧胫前肌相同部位各注射50μL（50μg）质粒,每只小鼠每次免疫的质粒总量为100μg。3周后以相同方法和剂量加强免疫1次。　　1.2.4弓形虫速殖子培养裂解物（TLA）的制备液氮冻存的弓形虫RH强毒株冻存管投入37℃水浴中复苏后,抽取0.1mL腹

8、腔注射ICR小鼠,待小鼠出现发病症状（如竖毛、不食、肛门拖粪、呼吸困难等）后,用3mL生理盐水冲洗小鼠腹腔,抽取的腹腔液腹