ct momp168多表位蛋白疫苗的免疫原性及免疫保护作用的分析

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1、优秀毕业论文lII]11IIIIIIFFIIIIIIIII＼1946024目中文摘要1●英文摘要．4l英文缩写词．．8前言9第一部分材料与方法11结果．16分析与讨论．18第二部分材料与方法20结果24分析与讨论27一第三部分●0材料与方法29结果．38分析与讨论45第四部分材料与方法47结果49分析与讨论．．53，J、结55参考文献．．56附录．62致谢．．63综述及参考文献64精品参考文献资料优秀毕业论文温州医学院硕士学位论文DMOMPl68多表位疫苗的免疫原性及其免疫保护作用的研究‘中文摘要目的：【1】培养、鉴定和纯化E血清型沙眼衣原体(C

2、hlamydiatrachomatis，c0【2】建立小鼠生殖道E血清cf感染模型【3】制备沙眼衣原体主要外膜蛋白(majoroutermembraneprotein,MOMP)MOMPl68多表位，研究MOMPl68多表位的免疫原性，包括体液免疫和细胞免疫；【4】研究MOMPl68多表位的对小鼠生殖道E血清Cf感染的免疫保护作用。方法：【1】将pET32㈣／CtMOMPl68重组质粒及pET32a(+)转化BL21菌株，通过IPTG诱导，并经Ni．NTA树脂亲和层析法纯化，制备CtMOMPl68多表位和载体蛋t刍(Trx-his)，用于免疫原性

3、和免疫保护作用研究；【2】采用Hep-2细胞培养E血清型沙眼衣原体(C黟并采用方法PCR，Giemsa、Lugol，S碘染和间接免疫荧光进行D包涵体的鉴定以及采用反复冻融和超速办离心的方法进行。纯化；3【3】小鼠生殖道E血清型。感染模型的建立：以106包涵体形成单位(Inclusionformingunits，wu)剂量的。原体(Elementarybody,EB)感染BALB／c小鼠生殖道，同时D保存液(SPG)作为阴性对照。小鼠感染。后，通过外生殖道炎症观察、阴道分泌物CtPCR鉴定、病理切片等分析小鼠模型是否构建成功；【4】选择乒8周BAL

4、B／e雌性小鼠，每组9只，用MOMPl68多表位重组蛋白免疫。同时设置PBS、载体蛋白(Trx．his)、灭活沙眼衣原体对照组。采用0、2、4W皮下多点注射免疫，共免疫3次；隔周采集阴道分泌液和断尾取血分离血清，分别进行分泌液IgA和血清培G、IgA、IgM、埯GI、IgG2a、192b、IgG3的检测，并在末次免疫后取小鼠脾淋巴细胞检测其CTL(CytotoxcityTlymphocytes，CTL)的杀伤活性和Elisa检测血清中细胞因子IFN．，t和Ⅱ，4的含量；【5】于末次免疫后第2周用106IFU的E血清型Q进行小鼠生殖道感染攻击。通过

5、下列方法分析其免疫保护作用。1．通过观察小鼠生殖道炎症观察和评分一●叩；一’并观察炎症的持续时间；2．通过ELISA检测小鼠生殖道特异性IgA抗体水平，及经断尾取血分离血清检测特异性IgG抗体水平；3．Ct攻击前后抗体水平比较，血清IgG抗体和阴道分泌物IgA；4．隔周采集阴道分泌物进行。分离和精品参考文献资料优秀毕业论文温州医学院硕士学位论文鉴定、并计数，以分析各组小鼠生殖道cf清除率等；5．Ct攻击后4周，取小鼠生殖器官进行大体和病理切片观察，以分析cf攻击产生的炎症情况。分析MOMPl68多表位重组蛋白对小鼠生殖道感染E血清型。攻击的免疫保

6、护作用。结果：^?rj．【1】通过原核表达系统，分别获得纯化MOMPl68多表位和载体蛋I刍(Trx．his)，蛋白表达量高达0．9mg／ml、0．6mg／ml。【2】E血清型Ct经感染Hep-2细胞培养72h,培养细胞经Lugos碘液染色法，Giemsa染色法、间接免疫荧光等方法进行。包涵体鉴定，同时进行PCR检测。的DNA，结果证实。培养成功。并经反复冻融和超速离心的方法获得了纯化的E血清型@其删值为lxl08IFU／ml。为建立生殖道感染模型和检测。奠定了实验基础。【3】MOMPl68多表位免疫BALB／e小鼠后，采用ELISA方法检测生殖

7、道分泌物及其血清中特异性抗体水平及其动态变化；采用LDH方法检测CTL的特异性杀伤及ELISA方法其血清内细胞因子水平。体液免疫：ELISA结果显示MOMPl68多表位免疫组能刺激机体产生较高抗灭活C睑菌体的特异性血清IgG和生殖道粘膜Igg抗体水平。随着免疫次数焉的增加，抗体水平持续上升；血清抗体的类型以IgGl为主；在末次免疫后检澳EJlgG抗体水平，MOMPl68多表位组分别与载体组(Trx．his)、PBS组相比有均≯显著差异性(Tl=12．587，p

8、OMPl68多表位免疫组与载体组、PBS组相比较：(T1=13．664,Wc0．001；T1=5．996，p=O．004)。灭活的。组I