重组结核分枝杆菌多表位肽的免疫原性研究

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1、重组结核分枝杆菌多表位肽的免疫原性研究作者：娄加陶，周晔，吴传勇，陈燕，蒋天舒，陈波，谷明莉，仲人前，邓安梅【摘要】目的探讨纯化的重组结核分枝杆菌多表位肽激发细胞毒性T淋巴细胞(CytotoxicTlymphocyte，CTL)免疫应答的能力，为新型结核疫苗的设计打下基础。方法通过细胞增殖和细胞毒性实验，研究纯化的重组表达多表位肽刺激外周血单个核细胞(PBMC)产生的增殖反应和细胞毒活性，初步鉴定重组多表位肽的免疫原性。结果以刺激系数（SI）＞3为界，多表位肽（10μmol）能刺激全部10例HLAA*0201阳性(A2+)结核菌素阳性(PPD+)健康个体的PBMC发生

2、增殖，SI为46.2±5.6；增殖反应明显高于单肽（平均SI为10.2±2.3）以及PPD（平均SI为15.6±3.6）引起的细胞增殖反应(P<0.01)。在多表位肽诱导的CTL细胞毒活性分析中以负载抗原肽（10μmol）的T2细胞作为靶细胞，多表位肽诱导的CTL作为效应细胞，多表位肽能诱导全部的10例A2+PPD+健康个体中CTL杀伤活性，平均活性分别为(86.2±9.6%)，显著高于单肽[平均为（25.4±3.6）%]和PPD[平均为(22.6±2.8)%](P<0.01)。结论重组优化多表位肽在细胞水平具有较好的免疫原性，能有效刺激PBMC产生

3、细胞增殖反应和细胞毒活性。【关键词】结核分枝杆菌；多表位肽；疫苗抗结核病的保护性免疫机制目前仍不清楚，但细胞免疫尤其是循环及感染部位的T细胞应答被认为起着重要作用。CD8+T细胞在抗结核感染中起着重要而独特的作用，尤其是近来AIDS和肺结核的重叠感染频率增加，因此设计以CTL表位为基础，诱导机体产生保护性CTL免疫应答，从而预防和治疗肺结核的疫苗越来越受到重视。但实践证明单纯利用CTL表位制成的肽疫苗或DNA疫苗，特异性CTL免疫应答的水平一般较低，效果都不甚理想。为　　了获得高效而特异的保护性CTL免疫应答，需要对单纯的CTL表位疫苗进行新的设计和改造。我们设计了含有

4、可引导表位肽进入抗原提呈细胞的“木马肽”序列以及PADRE泛Th表位，并采用了高尔基体内固有肽酶furin识别序列作为表位接头的“串珠式”多表位肽M6[1]。有研究表明，PPD+健康个体作为潜伏性结核分枝杆菌感染者，体内持续存在的抗原引起相应的免疫应答而产生的大量抗原特异性T细胞是机体免疫性保护作用的基础。因此其PBMC对结核分枝杆菌抗原的应答，可作为研究抗结核分枝杆菌保护性免疫的良好模型[2~5]。这样便可以采用PPD+健康个体的PBMC对候选表位或抗原的免疫反应性来验证其免疫原性。本研究探讨纯化的重组结核分枝杆菌多表位肽激发CTL免疫应答的能力，为新型结核疫苗的设计

5、提供良好的方案、奠定良好的基础。　　1材料与方法　　1.1研究对象　　10例HLAA*0201阳性健康志愿者，6例HLAA*0201阴性健康志愿者，均为PPD+。留取外周血20ml，肝素抗凝。　　1.2试剂和试剂盒　　LPS、人重组IL2、PPD、人重组GMCSF、人重组IL-4购自RD公司；FITC标记的抗CD3、抗CD8、抗HLA.A2流式单克隆抗体均为Caltag公司产品；HLAA2高分辨SSPPCR试剂盒购自OneLamda公司；时间分辨荧光DELFIA细胞增殖（AD0200）与细胞毒性（AD0016）检测试剂盒均购自I1640培养基中，37℃

6、5%CO2孵育1.5h。收集悬浮细胞，以10%二甲亚砜90%小牛血清保存于液氮备用。贴壁细胞为抗原提呈细胞－树突状细胞(DC)前体细胞，补充含GMCSF(1000U/ml)，IL4(1000U/ml)及含10%FCS的RPMI1640培养液，37℃5%CO2培养7d促其转化，需要时补充新鲜培养液。5d后，加入LPS(1mg/L)培养2d后促进DC成熟，γ照射使其失去增殖活性。将经过照射的DC分别与抗原肽、多表位肽、PPD(10μmol/L)在培养液中，37℃5%CO2共孵过夜。分别将1×105负载的DC与1×106自体PBMC种于含10%FCS的RPMI1640完全

7、培养液的24孔细胞培养板，37℃5%CO2混合培养3d后，加入rIL2(20U/ml)继续培养10d，进行细胞增殖实验和细胞活性检测。　　1.5细胞增殖实验　　细胞增殖实验采用时间分辨荧光DELFIA细胞增殖检测试剂盒。分别将经辐射的5×103负载的APC100μl与5×104抗原诱导的自体CTL100μl种植于96孔细胞培养板中（以空载的APC作为阴性对照），与20μlBrdU应用液共孵10h，离心洗1遍，加入Eu标记的抗BrdU单抗室温孵育2h，洗涤、固定后，经时间分辨荧光检测仪测定荧光强度值。每个样本设立3个复孔，取其平均值为检测