临床医学论文重组结核分枝杆菌多表位肽的免疫原性研究.doc

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1、临床医学论文•重组结核分枝杆菌多表位肽的免疫原性硏究作者：娄加陶，周晔，吴传勇，陈燕，蒋天舒，陈波，谷明莉，仲人前，邓安梅【摘要】冃的探讨纯化的重组结核分枝杆菌多表位肽激发细胞毒性T淋巴细胞(CytotoxicTlymphocyte，CTL)免疫应答的能力，为新型结核疫苗的设计打下基础。方法通过细胞增殖和细胞毒性实验，硏究纯化的重组表达多表位肽刺激外周血单个核细胞(PBMC)产生的增殖反应和细胞毒活性，初步鉴定重组多表位肽的免疫原性。结果以刺激系数(SI)〉3为界，多表位肽(10“mol)能刺激全部10例HLA

2、A*0201阳性(A2+)结核菌素阳性(PPD+)健康个体的PBMC发生增殖，S■［为46.2±5・6；增殖反应明显高于单肽(平均S■［为10.2±2.3)以及PPD(平均SI为15.6±3.6)弓［起的细胞增殖反应(P<0・01)。在多表位肽诱导的CTL细胞毒活性分析中以负载抗原肽(10//mol)的T2细胞作为靶细胞，多表位肽诱导的CTL作为效应细胞，多表位肽能诱导全部的10例A2+PPW健康个体中CTL杀伤活性，平均活性分别为(86.2±9・6%)，显著高于单肽［平均为(25.4±3.6)%］和PPD

3、［平均为(22.6±2.8)%］(P<0.01)。结论重组优化多表位肽在细胞水平具有较好的免疫原性，能有效刺激PBMC产生细胞增殖反应和细胞毒活性。【关键词】结核分枝杆菌；多表位肽；疫苗抗结核病的保护性免疫机制冃前仍不清楚，但细胞免疫尤其是循环及感染部位的T细胞应答被认为起着重要作用。CD8+T细胞在抗结核感染屮起着重要而独特的作用‘尤其是近來AIDS和肺结核的重叠感染频率增加，因吐设计以CTL表位为基础，诱导机体产生保护性CTL免疫应答，从而预防和治疗肺结核的疫苗越来越受到重视。但实践证明单纯利用CIL表

4、位制成的肽疫苗或DNA疫苗，特异性CTL免疫应答的水平一般较低，效果都不甚理想。为了获得高效而特异的保护性CTL免疫应答,需要对单纯的CTL表位疫苗进行新的设计和改造。我们设计了含有可引导表位肽进入抗原提呈细胞的“木马肽”序列以及PADRE泛Th表位，并采用了高尔基体内固有肽酶furin识别序列作为表位接头的“串珠式”多表位肽M6［l］。有硏究表明，PPEM•健康个体作为潜伏性结核分枝杆菌感染者，体内持续存在的抗原引起相应的免疫应答而产生的大量抗原特异性T细胞是机体免疫性保护作用的基础。因此其PBMC对结核分枝

5、杆菌抗原的应答，可作为硏究抗结核分枝杆菌保护性•免疫的良好模型［2~5］。这样便可以采用PPEM■健康个体的PBMC对候选表位或抗原的免疫反应性来验证其免疫原性。本硏究探讨纯化的重组结核分枝杆菌多表位肽激发CTL免疫应答的能力，为新型结核疫苗的设计捉供良好的方案、奠定良好的基础。1材料与方法1.1硏究对象10例HLAA*0201阳性健康志愿者，6例HLAA*0201阴性健康志愿者，均为PPD+。留取外周血20ml，肝素抗凝。1.2试剂和试剂盒LPS、人重组IL2、PPD、人重组GMCSF、人重组IL-4购自R&

6、D公司；FTTC标记的抗CD3、抗CD8、抗HLA.A2流式单克隆抗体均为Caltag公司产品；HLAA2高分辨SSPPCR试剂盒购自OneLamda公司；时间分辨荧光DELFIA细胞增殖(AD0200)与细胞毒性(AD0016)检测试剂盒均购自WailacOy公司；A或5A(242〜250aa.KLTANNTRV)由上海生工生物工程技术有限公司合成；T2细胞株由上海长征医院临床实验诊断科保存。1.3HLA分型先以鼠抗人HLAA2单克隆抗体(BB7.2)进行HLAA2流式细胞仪初步筛选，然后再以HLAA2高分辨

7、SSPPCR试剂盒进一步确认其A*0201亚型。1.4抗原肽诱导CTL制备用密度梯度离心法分离得到外周血单个核细胞，种于6孔细胞培养板，在含10%FCS的RPMT1640培养基中，37°C5液02孵育1.5h。收集悬浮细胞，以10%二中亚砚90%小牛血清保存于液氮备用。贴壁细胞为抗原提呈细胞-树突状细胞(DC)前体细胞，补充含GMCSF(1000U/ml)，IL4(1000U/ml)及含10%FCS的RPMI1640培养液，37°C5KO2培养7d促其转化，需要时补充新鲜培养液。5d后，加入LPS(1mg/L)

8、培养2d后促迸DC成熟r照射使其失去增殖活性。将经过照射的DC分别与抗原肽、多表位肽、PPD(10zzmol/L)在培养液中，37°C5液D2共孵过夜。分别将1x105负载的DC与1x106自体PBMC种于含10%FCS的RPMI1640完全培养液的24孔细胞培养板，37°C5%CO2混合培养3d后，加入rIL2(20U/ml)继续培养10d‘进行细胞增殖实验和细胞活性检测。1.5细胞