HPV6b L1ΔCt MOMP多表位嵌合核酸疫苗免疫保护作用的研究

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1、温州医学院硕士学位论文HPV6bL1△／甜MOMP多表位嵌合核酸疫苗免疫保护作用的研究中文摘要目的：【l】制备pcDNA3．1／HPV6bL1△／CtMOMP【人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)6b型晚期蛋白1／沙眼衣原体主要外膜蛋白(Chlamydiatrachomatis，Ct；majoroutermembraneprotein，MOMP)】多表位嵌合质粒；【2】建立小鼠生殖道Q感染模型；【3】研究HPV6bL1△／CfMOMP多表位嵌合核酸疫苗(简称为：HPV6bLl△／

2、CtMOMPl68)免疫对小鼠生殖道。感染的保护作用。方法：【l】采用QIAGEN质粒大量提取试剂盒提取pcDNA3．1(+)／HPV6bLl△／oMOMPl68重组质粒，同时提取pcDNA3．1、pcDNA3．1／CtMOMPl68DNA作为实验对照。并利用QIAGEN镍合胶制备pET32a／CtMOMPl68蛋白在Prime．boost免疫时使用；【2】采用Hcp．2细胞培养E血清型Ct(ATCCVR-348BTrachomaserotypeE)并进行。包涵体的鉴定以及D纯化；【3】小鼠生殖道cf感染

3、模型的建立：以106包涵体形成单位(Inclusionformingunits，IFU)剂量的。原体(Elementarybody，EB)感染BALB／c小鼠生殖道，同时Hep-2细胞感染另一组小鼠作为阴性对照。小鼠感染。后，通过外生殖道炎症观察、’阴道分泌物PCR鉴定、阴道分泌物做细胞培养鉴定CtIFU等证实模型是否构建成功：【4】选择6~8周BALB／c雌性小鼠，用pcDNA3．1(+归PV6bLI△／C'tMOMPl68核酸免疫。同时设PBS、pcDNA3．1、pcDNA3．1／CtMOMPl68作

4、为对照和Prime．boost免疫策略组对照(第1次先用pcDNA3．1(+)／HPV6bLl△／oMOMPl68核酸免疫，之后两次免疫用pET32a／CtMOMPl68蛋白)，采用O、2、4周肌肉注射免疫，共免疫3次；末次免疫后第2周用106IFUCtEBs进行攻击小鼠生殖道。隔周采集阴道分泌物进行细胞培养、PCR鉴定以及slgA检测，断尾取血分离血清检测IgG。初次免疫后第8周取小鼠脾淋巴细胞检测其CTL(CytotoxcityTlymphocytes，CTL)的杀伤活性和流式细胞术分析脾淋巴细胞胞内

5、细胞因子IFNl，IL-4，IL-10的分泌。并通过观察小鼠生殖道炎症和检测生殖道Cf清除率等指标来判定重组质粒组对小鼠温州医学院硕士学位论文生殖道感染Cf的保护效果。结果：【1】经Lugos碘液染色法进行鉴定，证实C，培养成功，为建立生殖道感染模型和检测C，奠定了实验基础；【2】提取阴道分泌物DNA进行PCR鉴定、阴道分泌物细胞培养计数CtIFU从而检测。清除率和组织病理切片证实106IFUCt剂量感染小鼠可以建立稳定的小鼠生殖道感染模型；【3】ELISA结果显示pcDNA3．1(+)／HPV6bLlA

6、／CtMOMPl68免疫组能刺激机体产生抗Cf全菌体的特异性IgG和slgA；攻击前后比较(第6周进行Q攻击，取第5周和第7周作为攻击前后对比)：经Cf攻击后1周就能够有效诱发再次免疫应答，血清IgG抗体(A490读数)均值分别为：0．669±0．058和0．951±0．038(T=2．77，p=0．008)。阴道分泌物sIgA第5周、7周比较：0．0401±0．045和0．542±0．040(T=2．17，p=0．001)。Prime．boost免疫策略组IgG抗体均值第5周、，周分别为：0．852±0

7、．058和1．231±0．032(T=2．78，p=O．001)。Prime．boost免疫策略组与pcDNA3．1(+)／HPV6bLl△／CtMOMPl68组有显著性差异(T_2．77，p=0．04)。sIgA第5周、7周分别为：0．523±0．027和0．781±0．052(T=2．78，p=O．001)Prime．boost免疫策略组与pcDNA3．1(+)／HPV6bLI△／CtMOMPl68组有显著性差异(T-2．77，p=O．001)。CTL细胞活性检测结果显示pcDNA3．1(+)／HPV

8、6bLl△／CtMOMPl68组免疫后能产生对靶细胞的特异性杀伤活性均值为46．40％，与对照组比较具有显著性差异(p<0．05)。流式细胞术(FCM)检测脾细胞胞内细胞因子结果显示，免疫后小鼠脾淋巴细胞能够产生较高的IFN-y，而IL-4和IL-10升高不明显，具有显著性差异(p