鸡传染性支气管炎病毒多表位核酸疫苗免疫效力研究

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3、demicDegreeappliedfor:MasterofAgricultureSpeciality:PreventiveVeterinaryMedicineResearchfield:InfectiousdiseasesofdomesticanimalsCollege:AnimalScienceandTechnologyCollegeMay,2015摘要鸡传染性支气管炎(Infectiousbronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectiousbronchitisvirus,IBV)引起的，严重危害养鸡业的重要的病

4、毒性传染病之一。因为IBV血清型众多，且不同的血清型之间的交叉保护力弱，给疫病的防控带来了极大的困难。目前IB的预防措施主要还是依赖于疫苗接种，生产中常采用的是弱毒苗和弱毒苗，弱毒苗存在毒力返祖和自然散毒的隐患，灭活疫苗虽然安全性好，但是其免疫保护效果维持时间短，需要多次注射免疫，所需的成本较高。核酸疫苗具有安全性好和诱导全方位的免疫应答等优点，而IBV的表面纤突（S）蛋白基因是最重要的免疫原性蛋白，能诱导良好的保护性免疫，它又分为S1和S22个亚单位，其中S1蛋白是决定IBV特异性抗原决定簇的主要蛋白。M基因相对而言保守性较高，与病毒复

5、制有关，且其可能存在具有免疫作用的抗原决定簇。因此，研制IBV表位核酸疫苗这种新型基因工程疫苗，对防制IBV具有重要的意义。本研究应用筛选出的IBV毒株的结构蛋白基因S1基因的T细胞抗原表位盒和B细胞抗原表位盒，酶切连接入真核表达载体pVAX，构建7组表位核酸疫苗，研究其免疫保护效力。分别利用前期筛选出的IBV的结构蛋白基因S1全基因、S1基因的T细胞抗原表位盒和结构蛋白M全基因，构建3组真核表达质粒：pVAX-S1、pVAX-S1T+M、pVAX-S1+S1T+M；IBV的结构蛋白基因S1基因的T细胞抗原表位盒、AustraliaT株和

6、M41株的S1基因的B细胞抗原表位，构建4组真核表达质粒pVAX-S1B(M41)、pVAX-S1B(T)、pVAX-S1T+S1B(M41)、pVAX-S1T+S1B(T)；将原有的质粒S1B(T)、S1T重新设计引物，改造酶切位点重新连接构成pVAX-S1BT+S1T。将每组提取制备的质粒溶液通过腿部肌肉多点注射的方式免疫7日龄SPF雏鸡，28日龄加强免疫一次。同时设立PBS组作为对照组。分别在首免前及免疫后的7d、14d、21d以及二免后的7d每组随机抽取3只鸡，翅静脉采血并分离血清，用间接ELISA方法检测特异性抗体水平。二免后第

7、10d用剂量106ELD50/只的IBV病毒液滴鼻点眼攻毒，通过保护率和排毒量检测的结果这两个指标来评价疫苗的保护效果。抗体效价结果显示：pVAX-S1、pVAX-S1T+M组与PBS组相比差异显著(p<0.05)；pVAX-S1B(T)、pVAX-S1T+S1B(M41)和pVAX-S1T+S1B(T)组与PBS组相比差异均显著(p<0.05)；pVAX-S1B(T)、pVAX-S1B+S1T组与PBS组相比差异均显著(p<0.05)。攻毒结果表明，疫苗免疫组pVAX-S1和pVAX-S1T+M免疫后，有效诱导了鸡体的免疫反应，分别能提

8、供80%(8/10)和70%(7/10)的保护率；疫苗组pVAX-S1、pVAX-S1T+M、pVAX-S1B(T)免疫后，其保护率明显增高，分别为75%(6/8)、I62.5(5/8)和75