鸡传染性支气管炎病毒分离株IBVWHNJM基因DNA疫苗研究

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1、四川农业大学硕士学位论文鸡传染性支气管炎病毒分离株IBV<,WHNJ>M基因DNA疫苗研究姓名：杨帆申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：王红宁20040601摘要本研究采用本课题组分离鉴定的鸡传染性支气管炎肾型毒株IBVw一，根据Genbank中已经注册的IBVM基因序列设计一对引物，通过RT-PCR方法扩增出IBV—，的M基因。对M基因克隆测序结果表明，IBv。M基因的编码序列全长678bp，编码225个氨基酸，与国内外发表的9个毒株M基因核苷酸序列相比较的同源性为91．6％100％，相应氨基酸同源性为91。60／一100％。将鸡传染性支气管炎病毒分离株IBvm。M基I虱在Ge

2、nbank中注册，注册号为AY302742。将已经克隆的IBv。。M基因亚克隆至真核表达质粒pcDNA3．1上，得到重组质粒，用酶切、菌落PCR鉴定，结果表明，M基因正确插入peDNA3．1中，成功制备了重组质粒pc-M。采用类脂薄膜水化法制备了阳离子脂质体，按10；l的比例用脂质体包被重组质粒pc．M，并通过透射电镜观察，结果表明，阳离子脂质体大小为30-200nm，包被后的复合物大小为50-400rim，形状不规则。本研究制成了IBV。。M基因pe-M重组质粒DNA疫苗、脂质体包被的mV—，M基因pc-M重组质粒DNA疫苗各一种。对脂质体包被的重组质粒pe-M组、重组质粒pe-M组和

3、空白对照组，进行了重组质粒DNA疫苗的免疫原性研究。试验组的免疫剂量为lml(含200ug,DNA)／羽，四点腿部肌肉注射，lO日龄首免，17日龄相同剂量二免，对照组不作任何处理。免疫前、24日龄、31日龄颈静脉采血，用全自动生化分析仪和BC-2000血细胞分析仪检测外周血液中免疫球蛋白和白细胞的含量，用SPSS软件对三组结果进行统计学计算，分析结果表明：IBvwm叮M基因DNA疫苗免疫后，外周血液中IgG、IgA、IgM含量显著升高，白细胞数量、淋巴细胞含量也显著提高，脂质体包被后免疫水平上升高于未包被组，而对照组无明显变化，统计结果表明，试验组与对照组相比差异显著。35日龄时以O．2

4、ml(102EID50)剂量的lBV。。株对各组攻毒，统计攻毒后的发病、死亡、保护情况。结果显示，攻毒后试验组没发病，对照组第四天发病，出现了呼吸道症状并有3只死亡，结果表明IBVM基因的DNA疫苗能诱导鸡体产生免疫应答，并对强毒感染有抵抗力。本研究采用IBV。。M基因构建的DNA疫苗对鸡进行免疫，并对其免疫效果进行评价，在国内外还未见报道。本研究为研制IBVDNA疫苗提供了科学依据。关键词：传染性支气管炎病毒，M基因，DNA疫苗¨本研究得到国家高技术研究发展计划(863计划)项目资助，编号为：2003AA241120j一、前言(一)禽传染性支气管炎病研究概况1概述禽传染性支气管炎(Av

5、ianInfectiousBronchitis，IB)是鸡的一种急性、高度接触性的传染病，其特征为病鸡出现呼吸道症状、产蛋数量和品质下降以及肾脏病变等。禽传染性支气管炎病毒(InfectiousBronchitisVirus，IBV)可感染所有日龄的鸡，导致生长迟缓、死亡、增重和饲料报酬降低；还常常引起霉形体混合感染以及大肠杆菌病等继发感染而提高鸡群的死亡率，给养鸡生产带来巨大损失。目前，该病呈世界广泛流行，是严重危害世界养禽业的重大传染病之一【lJ。IBV是冠状病毒科冠状病毒属的代表种，其抗原性复杂，目前世界上分离的IBV临床毒株已有100多株，分属30种以上血清型【2】。IBV不同毒

6、株在毒力、致病性和组织嗜性上存在着很大差异，不同血清型毒株之间交叉保护力弱【31。在防治上，常规单一毒株疫苗常有免疫失败的报道[41，弱毒疫苗还存在重组、毒力返强等问题。本课题组前期研制的多价灭活疫苗安全性好，不存在散播病原和毒力返强的问题，且能激发良好的体液免疫反应，其不足之处是使用剂量大，需要配合佐剂，制备比较复杂，因而成本较高。随着IBV流行病学调查、分子生物学研究、免疫机制探索以及病原变异机制探讨等工作的逐步深入，从基因水平上研制DNA疫苗，对于更好地解决IBV的免疫保护问题具有重要意义。2IBV的流行分布1931年Schalkl5J等首次报道了本病，Beach和Schalm于1

7、936年确定该病病原为病毒【6】，Beaudette和Hudson于1937年首次在鸡胚上培养该病毒17]。Jungherr掣8l于1956年报道了1951年分离的Coma株与1941年分离的MaSS株虽然引起相似的疾病，但存在抗原差异而不能交叉保护或交叉中和，这证实了IBV抗原多样性及其在传染性支气管炎流行病学中的重要性。之后在世界其他很多国家和地区都有该病的报道19]。1962年Wintefield【loJ等报道了肾型IB，分离