资源描述：
《鸡传染性支气管炎病毒广东分离株S1基因的克隆与序列分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、鸡传染性支气管炎病毒广东分离株S1基因的克隆与序列分析卢秀娴张思远叶贺佳梅廷媛广州市华南农大生物药品有限公司鸡传染性支气管炎(infectiousbronchitis,TB)是由鸡传染性支气管炎病毒(infectiousbronchitisvirus)引起的一种急性、高度接触性传染病,主要影响呼吸系统、消化系统、泌尿生殖系统等。各种日龄的鸡都会感染1BV,主耍引起呼吸困难、肾炎、产蛋量和蛋品质的下降，IBV还可侵害肾脏、肠道、腺胃、肌肉等组织，给养禽业带来经济上的损失。IBV自身有结构特殊性，并且RNA聚合酶具有不完善的纠错机制能力，使得病毒基因组在复制的过程易突变和重组频率增高，能
2、够产生许多血清型，目前已报道的血清型已有30多种，在我国主要以Mass,T,Gray和Holte株等为主。1BV基因组为线性单股正链RNA,全长约27.6kb,编码小膜蛋白(E)、膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)和纤突蛋白(S)4种主要结构蛋白。当S蛋白与宿主细胞膜上的病毒受体结合，并通过宿主细胞的蛋白酶裂解到S1和S2时，病毒包膜可与细胞膜结合，病毒纤突能表现出较强的特异性，S1基因是诱导和选择性接受中和抗体的特异位点。S1可刺激中和和血凝抑制抗体，只有S1蛋白能诱导中和抗体，使机体起到有效地保护。虽然IBV的遗传变界可以在基因组中的任何部分发牛，但主要集中在病毒的S1基因。S1蛋H
3、是主要的感染性和致病性的病毒蛋其结构差异性导致了血清型的差异及变异株的存在，并且与IBV抗原性漂变和致病性的改变有关，并且还可以决定1BV血清型特异性抗原决定簇。S1蛋白的氨基酸序列之间的差异性有可能改变毒株之间的血清型，导致新的变异株出现，使其抗原性或免疫原性的改变。木研究于2017年5月份在广东省某疑似患鸡传染性支气管炎的鸡场病料被分离到1株IBV,并对IBV分离株S1基因进行克隆、测序和序列基因遗传变异分析。一.材料与方法1.病料来源、SPF鸡胚及主要的试剂病料样品为2017年5月广东某鸡场疑似感染IBV鸡的气管、心脏、肝脏、肾脏等样品；10日龄SPF鸡胚购自梅里亚实验动物中心
4、；11日龄SPF鸡胚购自梅里亚实验动物屮心;RMA提取试剂盒购自TaKaRq公司、DL2000DNAMarker均购自北京全式金公司;2XPhantaPCRMasterMix购自诺唯赞生物公司；反转录试剂盒和核酸染料均购自TTANGEN公司，pMD20-T载体购自TaKaRa公司1.引物设计与合成根据Genbank中公布的IBVS1基因组序列，利用Primerpremier6.0软件及oligo6.0,针对1BV基因组S1基因的保守基因区间设计1对特异性检测引物IBS1（上游）:5,-TTCAGGTGGCGTTGATAC-3，（下游）：5'-AACCTTGGCCTACTCTGC-3'
5、;根据S1基因两端外的保守序列设计1对扩增S1全长基因的引物，引物的理论跨幅为1722bp,可将S1基因片段完全覆盖,引物序列:S1P1（上游）：5'-TTGAAAACTGAACAAAAGA-3',S1P2（下游）：5'-CCATAACTAACATAAGGGCA-3'。由英潍捷基贸易有限公司合成引物。2.病毒分离釆集临床病料（主要是气管肝脏、肾脏等组织），研碎后加入适量PBS,在-20°C和常温条件下反复冻融3次,8000r/min离心10min,取上清液，加入双抗（含200U/ml青霉素和200ug/ml链霉素）混合，作用2h后，取0.2ml接种于11日龄SPF鸡胚的尿囊腔，放于3
6、7°C培养箱中孵育。36~48h后收取鸡胚的尿囊液,连续在SPF鸡胚上盲传3代。3.IBV分离株RT-PCR鉴定和S1全长基因扩增提取病毒的尿囊液中的RNA基因组，按照天根反转录试剂盒说明书进行反转录。以合成的cDNA为模板，采用S1基因特异性检测引物与S1基因全长引物分别进行PCR扩增,反应条件为:95°C预变性5min;95°C变性30S,54°C退火30S,72°C延伸2min,35个循环;72°C延伸10min。PCR反应结束后取产物以110V,50mA电流进行电泳，结果约25min后在凝胶成像系统紫外灯下观察。4.IBV分离株S1基因的克隆测序按照胶回收试剂盒说明书，回收P
7、CR扩增的IBVS1全长基因片段，将回收的PCR产物与pMD20-T克隆载体4°C连接过夜，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，涂平板蓝白斑筛选，挑去白色单菌落接种到LB液体培养基中，于37°C恒温培养振荡器内震荡培养12h后，菌液经PCR鉴定后，呈阳性的被选送至英潍捷基贸易有限公司测序部进行基因全长序列的测定及拼接。5.IBV分离株S1基因的序列分析MEGA6.0分析软件进行比较测定的S1基因序列，与参考株绘制遗传进化树。其中序列比对使用ClustalW多重
