新型肝片吸虫多表位疫苗的研究

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1、分类号：S852密级：公开UDC：编号：120906010882012级攻读硕士学位研究生毕业论文新型肝片吸虫多表位疫苗的研究Studiesonanovelmulitiple-epitopevaccineagainstFasciolahepatica指导教师：陈刚教授学生姓名：李润乐学科专业名称：基础兽医学研究方向：高原适应生理学学院(系、部)：农牧学院论文起止时间：2012.10—2015.6QinghaiUniversityMasterDissertationStudiesonanovelmulitiple-epitopevacc

2、ineagainstFasciolahepaticaSupervisor:ChenGangCandidate:LiRunleAcademicMajorApplidedfor:BasicVeterinaryMedicineSpecificMajor:PlateauadaptationphysiologyCollege(Department):AcademyofagricultureandanimalhusbandryApril,2015独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中

3、己经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：曰期:年6月学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权青海大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以釆用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本论文属于：保密•不保$/(请在相应

4、方框内打“十),在年解密后适用本授权书。学位论文作者签名:指导教师签名曰期：年6月七曰日期：风年厂月青海大学硕士学位论文摘要摘要本课题组依据机体对肝片吸虫的免疫保护机制和表位疫苗的构建理论，合理选择肝片吸虫鞘脂激活样蛋白2（FhSAP-2）的Th和B细胞抗原表位，结合生物信息学软件的分析，设计出一个结构新颖的多表位疫苗CTB-SAPE、两个单表位疫苗CTB-S1和CTB-S2。进一步通过基因克隆、表达及蛋白纯化等技术，获得该疫苗的重组蛋白，继而利用免疫学实验鉴定了多表位疫苗CTB-SAPE的免疫原性和免疫特异性。实验方法及结果简述如下

5、：1、肝片吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白2(FhSAP-2)的原核表达及分离纯化生物信息学软件OptimumTMCodon优化密码子适应指数（CAI）、最优密码子频率（FOP）及GC含量以获得适合大肠杆菌BL-21表达的FhSAP-2基因序列，并克隆到原核表达载体pET22b和pET28a中，经IPTG诱导其表达并经亲和层析及离子交换色谱纯化后获得目的蛋白。结果OptimumTMCodon获得优化后的FhSAP-2序列，经测序及酶切鉴定结果表明重组质粒pET22b-FhSAP-2、pET28a-FhSAP-2构建成功，进一步实验结果表明FhS

6、AP-2在pET28a中包涵体部位表达，可溶部位不表达；在pET22b中可溶部位表达量低，包涵体部位无表达。继而经Ni-NTA柱亲和纯化及离子交换色谱纯化获得电泳纯的FhSAP-2蛋白。2、多表位疫苗CTB-SAPE的设计及重组表达载体的构建本课题组在前期文献调研基础上合理选择FhSAP-2优势B和Th细胞抗原表位，通过表位疫苗的构建理论和生物信息学分析，对FhSAP-2抗原表位的连接顺序、间隔序列（Linker）和表位拷贝数，加以分析和确定，为了更好地激活粘膜免疫，在疫苗的设计中引入了分子内佐剂CTB，最终设计出具有科学合理结构的肝

7、片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE，并在此基础上设计两个单表位疫苗CTB-S1和CTB-S2。利用酶切和PCR技术构建了重组表达载体pETCTB-SAPE、pETCTB-S1和pETCTB-S2，并将其转入BL21（DE3）大肠杆菌中。实验结果表I青海大学硕士学位论文摘要明：重组表达载体pETCTB-SAPE、pETCTB-S1和pETCTB-S2与设计序列完全一致。3、新型肝片吸虫多表位疫苗CTB-SAPE的表达与纯化本研究诱导表达各个肝片吸虫表位疫苗抗原蛋白CTB-SAPE、CTB-S1和CTB-S2并经Ni-NTA亲和层析纯化目的

8、蛋白。实验结果表明：CTB-SAPE、CTB-S1和CTB-S2均可获得高效表达，并且主要以包涵体形式表达；经Ni-NTA亲和层析纯化后得到电泳纯的CTB-SAPE、CTB-S1和CTB-S2，为肝片吸虫多表位疫苗CTB