研制具有较高免疫保护作用的DNA疫苗

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1、研制具有较高免疫保护作用的SjserpinDNA疫苗立项依据目前我国仍有108个县有血吸虫病流行，69.5万人感染血吸虫病，并且随着近年来长江洪水泛滥和退耕还湖又有重新升高的趋势[1]。多年来，控制血吸虫病以化疗为主．辅以易感地带灭螺的综合性防治措施，取得较好的效果。但由于在流行区化疗停止后再感染迅速出现和长期、反复、大规模使用吡喹酮化疗，血吸虫对吡喹酮的潜在耐药性，迫切需要发展血吸虫疫苗以补充血吸虫病的防治措施[2]。DNA疫苗作为一种新型的疫苗，已在包括寄生虫感染在内的多个领域内开展了广泛研究[3]．

2、但是现行的酶抗原，血吸虫肌球蛋白组抗原，血吸虫膜相关蛋白，血吸虫钙相关蛋白，血吸虫线粒体相关蛋白和信号蛋白，血吸虫性别相关蛋白等制作出的DNA疫苗的免疫保护效果仅有小幅增加[4]。最新研究表明，来自哺乳动物内部的消化酶：胰蛋白酶和胰弹性蛋白酶(PE)很容易被抑制[5],以纤溶酶原激活物抑制因子2为代表了一种细胞抑制剂（serpin）可以通过一种独立的途径（不经过内质网和高尔基体）分泌到细胞外[6]。据文献[7]报道多房棘球绦虫六钩蚴入侵人体阶段，分泌的serpin，能够阻断宿主消化酶的酶解攻击，这样，Sj

3、serpin就可以在免疫系统做为一个靶位，引发免疫反应[8]。因此，本实验将能够表达serpin的血吸虫的一段cDNA进行PCR扩增，制作出SjserpinDNA疫苗，并对小鼠保护性免疫进行检测，进而为人类血吸虫防治提供新思路。实验摘要提取全长的日本血吸虫中国大陆株丝氨酸蛋白酶抑制剂(Sjserpin)基因，并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1，构建DNA疫苗pcDNA3.1—serpin；制备SjserpinDNA疫苗和对照pcDNA3.1。将20只BALB/c小鼠随机分为A、B2组。A组小鼠肌注1

4、00ugpcDNA3.1；B组注射100ugpcDNA3.l-Sjserpin。每隔2周各免疫1次，共3次。第8周每鼠感染30±2条／只尾蚴，45d后剖杀，计数成虫及肝内虫卵。采用免疫组化法检测局部组织中Sjserpin的表达；用脾细胞培养法检测经Sjserpin刺激后．攻击前、后小鼠脾细胞IL-2,IL-4,IL-10和IFN-r的水平。用ELISA检测血清中抗Sjserpin抗体。实验内容动物保护性实验2DNA疫苗pcDNA3.1-Sjserpin的制备1研究SjserpinDNA疫苗作用机制3数据处

5、理4实验方法步骤1.11.1引物的设计与合成根据Sjserpin的基因序列设计两条引物P1和P2，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，分别在Pl和P2的5'端引入BamHI和Xhol的酶切位点。以日本血吸虫童虫cDNA文库为模版进行PCR扩增。1.DNA疫苗pcDNA3.1-Sjserpin的制备Sjserpin亚克隆入pcDNA3.11.2将PCR产物与T载体pMD18-T连接，并转化感受态细菌，培养提取Sjserpin，并以此为模板进行PCR扩增，产物Sjserpin再与pcDNA3.1连接，用同

6、样方法得到重组质粒[9]。重组质粒经酶切鉴定，作DNA测序进一步确认。1.3DNA疫苗pcDNA3.1，pcDNA3.1-Sjserpin的制备按说明书用大规模质粒纯化试剂盒Qiagen2500大量制备，制得的质粒。DNA溶解于无菌的生理盐水(0.9％)中．在核酸蛋白测定仪上测定OD值，计算DNA浓度。2.动物保护性实验将20只小鼠随机分为A，B2组，每组10只。A组(pcDNA3.1组)经小鼠股四头肌注射100ugpcDNA3.1质粒DNA；B组(Sjserpin组)注射100ugpcDNA3.l-sj

7、serpin质粒DNA。分别于第0、2、4周各免疫接种一次（剂量和方法相同)．于第8周每鼠以30+/-2条／只尾蚴用腹部贴片法攻击感染，攻击后45d剖杀小鼠收集成虫计数，取出肝脏称重后用5％KOH37℃消化过夜，进行虫卵计数。按公式：减虫率=(对照组平均每鼠成虫数-实验组平均每鼠成虫数)／对照组平均每鼠成虫数×100％．减卵率=(对照组平均每鼠虫卵数一实验组平均每鼠虫卵数)/对照组平均每鼠虫卵数×100％．计算减虫率及减卵率。3.13.研究SjserpinDNA疫苗作用机制Sjserpin在小鼠局部肌肉组

8、织内的表达每组各取2只小鼠在第一次免疫后10d再以同剂量加强免疫一次，4d后剖杀小鼠，取两腿股四头肌做冰冻切片，Sjserpin的组化检测首先在每张冰冻切片上加入日本血吸虫重感染兔血清．4℃过夜后加二抗羊抗兔IgG-HRP，反应后经DAB显色，显微镜下观测结果。3.2细胞因子检测访谈结果与析双抗体夹心法分别于攻击前后2周每组各取两只小鼠拉颈处死，取出脾脏，常规法制备单个脾细胞悬液，用10％FCSRPMI1640完全培养液调整细