卡介苗初免-dna疫苗加强免疫策略的抗结核保护效果研究

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1、万方数据卡介苗初免一DNA疫苗加强免疫策略的抗结核保护效果研究Theprotectiveefficacyof“BCGprime-DNAboosterll’regimenagainsttuberculosis硕士研究生：康涵学号：10211300003导师：沈芳主任技师范小勇副研究员导师小组成员：吴文娟主任技师DouglasB．Lowrie教授公共卫生临床中心二0一三年四月万方数据复旦大学硕士学位论文目录lIIIIIIIIILIIIJlllllllllIIHIIllllllllIllIY2704851中文摘要⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯—1．￡一—jL一日U舌第一部分A985ADNA疫苗的构建和制备引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯材料与方法结果讨论第二部分BCG初免．A985ADNA加强免疫策略的保护效果评价引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯讨论第三部分BCG初免一A985ADNA加强免疫策略的免疫原性分析引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯讨论参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯论文总结及创新点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一综述附录致谢135711131830473823O13456万方数据复旦大学硕士学

4、位论文中文摘要摘要目的制备表达免疫优势抗原A985A的DNA疫苗，以其加强卡介苗(BacillusCalmette．Guerin，BCG)初免的作用，并评价其抗结核(Tuberculosis，TB)的作用；同时分析疫苗接种后诱导的T细胞应答，并探讨其与免疫保护的关系。方法以真核表达载体pVAXI重组表达分枝杆菌抗原A985A，制备不含内毒素的DNA疫苗A985ADNA。分别以PBS、BCG、BCG．A985ADNA(BCG初免一A985ADNA加强)、A985ADNA免疫小鼠，在免疫后8周进行结核分枝杆菌(M

5、ycobacteriumtuberculosis，Mtb)攻击感染。感染后第l周和第5周，分别计数感染小鼠脾和肺内的荷菌量，同时分析其肺和脾组织匀浆中IFN-y、TNF．Q、IL．2、IL．12、IL一4、IL-6、IL一10和TGF．D等细胞因子的表达，并对第5周小鼠的脾和肺进行病理学检查和免疫组化分析，以评价该免疫策略对小鼠的抗结核保护作用。免疫后第8周，分别制备小鼠的肺和脾单细胞悬液，ELISPOT分析抗原特异的IFN．Y的分泌，流式细胞术分析T淋巴细胞Mtb特异的IFN-Y、TNF—Q和IL一2的分泌

6、及其CD44、CCR7、CD62L的表达，以评价该免疫策略的免疫原性并分析其与免疫保护效果之间的关联性。结果A985A基因成功插入pVAXI质粒，测序结果与GenBank公布的完全一致。免疫小鼠攻击后第l周，肺CFU(colonyformingunit，菌落形成单位)计数各组间没有显著差异，脾内尚不能检测到Mtb的存在；攻击后第5周，BCG．A985ADNA组脾和肺内的CFU均最低，BCG组与PBS组相比亦有显著的下降，但A985ADNA组与PBS组、BCG组相比均无显著的统计学差异。病理学检查BCG．A98

7、5ADNA组的病理损害也最轻。感染后第1周细胞因子的表达肺和脾几乎都没有统计学差异，第5周IFN-y、IL．2、IL．12、IL．10、TGF．D均为A985ADNA组最高，BCG组次之，BCG．A985ADNA组最低，PBS组与BCG—A985ADNA组相差不大，其他因子组间差异较小。免疫后第8周(未感染)的小鼠CD4T细胞反应的评价发现：PPD特异的IFN-丫分泌细胞BCG组和BCG．A985ADNA组比PBS和A985ADNA多，但两者间无明显差异；A985A特异的IFN-7分泌细胞BCG．A985AD

8、NA组则仅比PBS组高。流式细胞术分析单个细胞水平的IFN吖、TNF．c【及IL．2的表达，BCG．A985ADNA免疫小鼠能产生较高频率的IL．2+、IL．2+TNF—Oc+、IFN．丫+IL．2+以及IFN．Y+TNF．矿IL．2+多功能CD4T细胞(p