旋毛虫nudix水解酶dna疫苗构建及其诱导的免疫保护

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1、学校代码10459学号或申请号201212262819密级公开邶糾kf硕士学位论文旋毛虫Nudix水解酶DNA疫苗构建及其诱导的免疫保护作导学专培者师科业养姓姓门名院名：刘珮名：王中全教授类：医学称：病原生物学（寄生虫学)系：基础医学院完成时间：2015年4月AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterEstablishmentofDNAvaccinewithNudixhydrolasefromTrichinellaspiralisanditsinducingimmuneresponseByPeiLiuS

2、upervisor:Prof.ZhongquanWangPathogenBiologyBasicMedicalCollegeApril2015学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研宄所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：如曰期：年1月、曰学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同

3、意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：曰期�x?/上年上月>曰旋毛虫Nudix水解酶DNA疫苗构建及其诱导的免疫保护硕士研究生刘珮导师王中全教授郑州大学基础医学院寄生虫学教研室（郑州450052）河南省分子医学重点学科开放实验室（郑州450052）摘要旋毛虫病是一种几

4、乎呈全球性分布的食源性人兽共患寄生虫病，主要因生食或半生食含旋毛虫幼虫的猪肉而感染。目前对旋毛虫病尚无有效的预防疫苗和控制方法。因此，世界各国每年投入大量人力、物力及财力用于动物肉类中旋毛虫的检疫与兽用疫苗的研究，希望阻断旋毛虫病由动物向人类的传播。近年来，感染性疾病的预防性DNA疫苗和肿瘤的治疗性DNA疫苗的研究发展很快。DNA疫苗在接种后，其免疫和病毒的自然感染过程相似，促进黏膜免疫的发生，诱导免疫记忆反应，以及交叉保护反应，外源的目的基因可以在体内不断表达蛋白，刺激免疫系统，所以DNA疫苗可诱发机体产生相对持久的免疫反应。旋毛虫对宿主小肠上皮细胞的附着、侵入是其致病的

5、关键，但其侵入机制目前尚不清楚。目前推测旋毛虫对小肠上皮细胞的侵入可能是通过幼虫的某些分泌性蛋白（即侵入相关因子）所介导的。本课题组前期通过旋毛虫肠道感染性幼虫与肌幼虫的抑制消减杂交cDNA文库，筛选出了一种分子量为46kDa且具有水解酶活性的旋毛虫Nudix水解酶（TsNd），本论文采用减毒沙门氏菌介导TsNd基因进入小鼠体内表达，重组质粒通过真核表达载体进行携带，尽最大程度保证TsNd基因表达的蛋白与天然蛋白有相似性。以口服方式使TsNd重组沙门氏菌进入体内，之后侵入肠道黏膜淋巴组织，目的基因就可以在抗原递呈细胞中表达。TsNd重组菌免疫过程与旋毛虫天然感染阶段相似，含

6、整个肠道阶段均同时以肠道为入侵起点。此外，本文还应用基因工程技术构建TsNd基因的重组真核表达质粒（即TsNdDNA肌肉注射疫苗），接种动物后观察其在体内的表达及其诱导的免疫应答与免疫保护效果。I材料与方法1.旋毛虫虫种，载体，菌株，实验动物及细胞系旋毛虫（T1）由本教研室昆明小鼠传代保种。pcDNA3.1+载体质粒，大肠埃希菌（E.coli）JM109，由本实验室冻存保存。雌性4周龄BALB/c小鼠购自河南省实验动物中心。所用细胞系为乳仓鼠肾细胞BHK-21，来自河南省疾控中心细胞资源中心。鼠伤寒沙门氏菌⊿cyaSL1344株由河南科技大学动物科技学院动物疫病与公共安全重

7、点实验室惠赠。2TsNd的克隆及真核表达载体的构建应用生物信息学与ORFFinder在线预测工具分析TsNd基因的ORF，TsNd基因从第111位到1358位，总长1248bp，编码415个氨基酸。设计并合成PCR引物，扩增出TsNd基因片段，将其插入到载体pcDNA3.1中构成重组质粒pcDNA3.1-TsNd,对其进行酶切以及测序鉴定正确后，将部分电转化入减毒沙门氏菌中，另一部分转化入大肠杆菌BL21中保存。3重组沙门氏菌的构建及其在小鼠体内的转录和表达在核酸水平，将TsNd基因电转化后的沙门氏菌液进行PCR鉴