ipro1ppe68 dna疫苗的构建及诱导balbc小鼠免疫应答的研究

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1、重庆医科大学硕士学位论文Ipro1/PPE68DNA疫苗的构建及诱导BALB/c小鼠免疫应答的研究姓名：张壮苗申请学位级别：硕士专业：病原生物学指导教师：杨春201205lprl／PPE68DNA疫苗的构建及诱导BALB／c小鼠免疫应答的研究1摘要目的2构建pBud-Iprl-PPE68一On2Vl穿梭质粒，观察鼠胞内抗性基因1(intracellularpathogenresistance1，Iprl)和PPE68基因在鼠巨噬细胞株RAW264．7内的表达。并将Iprl／PPE68DNA疫苗免疫BALB／c小鼠，探讨其诱导体内免疫应答

2、的情况。方法：1、Iprl基因、PPE68抗原编码序列分别插入pBudCE4．1质粒的多克隆位点，经酶切测序鉴定后，构建pBud680Iprl质粒，将其转染入巨噬细胞株RAW264．7，通过RT-PCRWesternBlot检测Iprl和PPE68蛋白的表达。结核分枝杆菌的复制子(Mycobacteriumtuberculosisoriginofreplication，o栅)的编码序列分别插入到pBud68一Iprl质粒的ArheI位点，构建pBud-Iprl-PPE68一On2vl穿梭质粒。2、pBud-Iprl-PPE68一。蝴穿梭

3、质粒免疫BALB／c小鼠，在末次免疫后2周，ELISA法检测小鼠体内的lgG2a、IL一12以及IFN-y的表达水平，MTT法检测脾淋巴细胞增殖的情况，流式细胞仪检测CD4+和1本课题由国家自然科学基金(30771922)资助3CD8+T细胞的数量，同时通过病理切片观察BALB／c小鼠肺脾组织的病理变化。结果：l、经过酶切测序鉴定pBud-Iprl-PPE68一OriM穿梭质粒构建成功，RT-PCR、Westem-Blotting鉴定Iprl和PPE68蛋白在巨噬细胞株RAW264．7表达成功。2、pBud-Iprl-PPE68一On_

4、qVI穿梭质粒免疫后的BALB／c小鼠血清内的lgG2a、IL一12、IFN-T以及CD4+和CD8+T细胞数量都表现出了有意义的提高。脾淋巴细胞的增殖水平与BCG相比没有区别。肺脾组织均未观察到病理学变化。结论：1、成功构建了pBud-Iprl-PPE68一OriM穿梭质粒，转染后的巨噬细胞株RAW264．7能够表达Iprl和PPE68蛋白。2、该疫苗能够有效诱导BALB／c小鼠Thl型免疫反应，为下一步研究其抗结核分枝杆菌感染的免疫保护作用奠定基础。关键词：结核分枝杆菌，Iprl，PPE68，DNA疫苗，免疫应答4CONSTRUCT

5、IoNANDITS耶江唧NERESPoNSEOFIprl!PPE68DNAVACCINEObjective：ToconstructanewshuttlephsmidpBud-Iprl-PPE68一OrilVl，observetheexpressionofintracellularpathogenresistance1(Iprl)proteinandPPE68antigeninthemacrophageRAW264．7，andstudytheimmuneresponseinducedbytheIprl／PPE68DNAvaccineinB

6、ALB／cmice．Methods：1．IprlgeneandthecodingsequencesofPPE68wereclonedintotheMCSsitesoftheplasmidpBudCE4．1，andtheplasmidpBud68-Iprlwasconstructed．AfteridentifiedbyrestrictionendonucleasedigestionandDNAsequencing，theplasmidpBud68-IprlWastransfectedintotheRAW264．7．Theexpressio

7、nofIprlandPPE68proteinweredetectedbyRT-PCRandWestem-Blot．ThecodingsequencesofMycobacteriumtuberculosisoriginofreplication(o词Ⅵ)wereclonedintothe^仇IsiteoftheplasmidpBud68-Iprl，theshuttleplasmidpBud-Iprl-PPE68一On2VlWasconstructed．2．TheBALB／cmicewereimmunizedwiththeshuttlepl

8、asmidpBud-Iprl-PPE68-On2VI．Twoweeksatterthelastimmunization，thelevelsoflgG2a，IL-12andIFN-TinseNlmwerean