弓形虫rop18的表达、纯化及初步应用

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1、分类号世82：5UDC———』上—————一密级公珏编号!Q211S1Q14Q13@江薛大擎硕士学位论文MASTER’SDISSERTATIoN论文题目弓形虫ROPl8的表达、纯化及初步应用学科专业作者姓名指导教师答辩日期病原生物学鞠爱萍陈盛霞教授2013年6月10日分类号B三墨2：§UDC6l密级公五编号!Q2窆窆S!Q!垒Q!王硕士学位论文＼删弓形虫ROPl8的表达、纯化及初步应用Expression、

2、lr‘f。cat‘onand)reI。。nar'Iicat。onExprsspuriIa10nprIminarYap

3、pIal：10nI、tofROPl8fromToxoplasmagondii作者姓名：鞠爱萍指导教师：陈盛霞教授申请学位：硕士学科专业：病原生物学论文提交日期：2013年04月26日论文答辩日期：2013年06月10日学位授予单位：江苏大学学位授予日期：2013年06月答辩委员会主席：张竹繁教授评阅人：独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中己注明引用的内容以外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果，也不包含为获得江苏大学或其他教育机构的学位或

4、证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：翔蟹著日期：)017年ob月f；日学位论文版权使用授权书江苏大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊(光盘版)电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致，允许论文被查阅和借阅，同时授权中国科学技术信息研究所将本论文编入《中国学位论文全文数据库》并向社会提供查询，授权中国学术

5、期刊(光盘版)电子杂志社将本论文编入《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》并向社会提供查询。论文的公布(包括刊登)授权江苏大学研究生处办理。本学位论文属于不保密团。学位论文作者签名：翔量并2。、；年喝月16日指导教师签名：油穗各v，j．年曲月·；日江苏大学硕士学位论文摘要目的：克隆刚地弓形虫RH株速殖子棒状体蛋白(rhoptryprotein，ROP)18基因编码序列，进行原核表达并制备多克隆抗体，采用间接免疫荧光技术(Indirectimmunofluorescenceassay，IFA)技术和免疫印迹(Westernbl

6、otting)技术检测不同时间ROPl8蛋白在虫体内分布及表达量的变化，为深入研究ROPl8在弓形虫入侵细胞中的作用提供基础。方法：根据ToxoDB基因库中ROPl8基因序列，DNAstar软件设计并合成l对特异性引物。体外培养并收集弓形虫RH株速殖子，提取其总RNA，经反转录聚合酶链反应(RT-PCR)得到弓形虫cDNA。以cDNA为模板，运用聚合酶链反应(PCR)技术扩增ROPl8基因片段，分别构建重组质粒ROPl8／pTGl9一T和ROPl8／pET-28a(+)，经PCR和酶切鉴定后，在大肠埃希菌Rosetta(D

7、E3)菌株中诱导表达。采用KCI染色切胶纯化法纯化重组ROPl8蛋白。纯化的重组ROPl8蛋白经皮下注射免疫家兔，制备其兔多克隆抗体，采用Westernblotting技术和IFA技术对多克隆抗体进行鉴定。选择不同实验时间点，应用IFA和Westernblotting技术定位和检测ROPl8在弓形虫速殖子体内的分布与表达。结果：从弓形虫RH株速殖子cDNA中扩增出l665bp的ROPI8基因片弓形虫ROPl8的表达、纯化和初步应用段，成功构建重组质粒ROPl8／pET028a(+)，并在Rosetta(DE3)菌中大量表达

8、，以包涵体形式存在。SDS．PAGE结果表明，67kDa处有一条明显的蛋白表达条带，与理论推测大小一致。采用KCl染色切胶纯化法获得纯化的目的蛋白。以纯化的重组蛋白免疫家兔获得高效价的多克隆抗体。经Westernblotting技术检测出弓形虫RH株速殖子在55kDa处有特异性条带，IFA技术检测速殖子内ROPl8分布于虫体前端胞质内，与棒状体位置基本一致，表明成功制备ROPl8多克隆抗体。IFA技术清晰可见不同时间点ROPl8在弓形虫体内的分布，随着感染时间的延长，绿色荧光逐渐增强；采用Westernblotting技术

9、检测相应时间点ROPl8表达量的变化，结果表明，随着感染时间延长ROPl8表达量逐渐升高，与IFA结果一致。结论：成功构建了重组质粒ROPl8／pET-28a(+)，并将其导入大肠埃希氏菌Rosetta(DE3)中得到高效表达，通过制备多克隆抗体，利用Westernblotting技术和IFA技术对多克