HIV-lgp120基因片段的克隆、表达、纯化、鉴定和初步应用

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1、中文摘要HIV．1gpl20基因片段的克隆、裹达、纯化、+鉴定和初步应用摘妥目的：人免疫缺陷病毒(HtV)是引起艾滋病的病原体，分为两型，HIV．1和HIV．2。HIV．1在全球范围传播广泛，是艾滋病流行的主要病原体。HIul外膜蛋白gpl20(HIV-1envgpl20，简称gpl20)是HIV-I的重要抗原成分，是检测抗gpl20抗体诊断HIV-I感染试剂盒的重要组成成份，也是制备抗gpl20单克隆抗体必需的免疫原，应用十分广泛，意义十分重大。本文旨在通过基因工程的方法获得高纯度的gpl20抗原。方法l以HIV．1HXB2cDNA为模板进行PCR，扩增出gpl20抗原的基因片

2、段，再将这段基因片段与T载体pMD-18T连接，构建重组克隆质粒pMD-18T．120。经PCR、双酶切和Ⅸ叮A序列分析鉴定后，用NdeI和XhoI对基因重组正确的克隆进行酶切，将所得目的基因插入到质粒pET-22b相应的多克隆位点，构建重组表达质粒pET．22b．gpl20，进行PCR、酶切鉴定和DNA序列分析。用鉴定基因重组正确的表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG小量诱导，诱导产物用SDS-PAGE电泳进行分析。选择可产生目的蛋白的克隆，转接至2L的LB培养基扩增培养，IPTG诱导，诱导4小时后收集菌体。超声破碎菌体，分离包含体和上清，SDS．PAGE证实目的蛋

3、白主要存在于包含体中。洗涤包含体，盐酸中文摘要胍裂解，通过金属离子亲和层析和分子筛层析对目盼蛋白进行纯化。用SDS．PAGE和HPLC对重组蛋白的分子量和纯度进行分析，并通过Westernblot的方法对其进行鉴定。以纯化的重组gpl20蛋白片段作为抗原，制备ELISA间接法检测血清中抗gpl20抗体的试剂盒，并用10份国际标准血清检测该试剂盒的敏感性和特异性。结果：1对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，可见在500bp和750bp之间有～个明显的条带，与预期扩增的gpl20基因片段的长度667bp相符。2对重组克隆质粒pMD-18T-120进行PCR和双酶切鉴定，PCR产物和酶切产

4、物进行琼脂糖凝胶电泳，均可在500bp和750bp之间发现一个明显的条带，与预期连接的667bp的gpl20基因片段相符。DNA序列分析结果与gpl20基因片段的相应序列一致。表明目的基因已被正确克隆。3重组表达质粒pET-22b。gpl20进行PCR和双酶切鉴定，PCR产物和酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，均可在500bp和750bp之间发现一个明显的条带，与预期插入的667bp的HIV-lgpl20基因片段相符。DNA序列分析结果与gpl20基因片段的相应序列一致。表明表达质粒构建成功。4重组表达质粒pET-22b．gpl20转化大肠杆菌BL21(DE3)后，对IPTG小量诱导产

5、物进行SDS．PAGE电泳分析，与空白对照[pET-22b转化大肠杆菌BL21(DE3)后的IPTG小量诱导产物1相比较在分子量20．1kD和中文摘要30kD之间可发现有一个明显的蛋白条带，与预期获得的25kD的gpl20抗原片段一致。表明重组表达质粒可以正确表达目的蛋白。对超声破碎后离心所得的包含体和上清进行SDS．PAGE电泳分析，证实目的蛋白主要存在于包含体中。凝胶扫描呈像分析证实目的蛋白占菌体蛋白总量的24．72％，占包含体蛋白的57．85％。5目的蛋白纯度：包含体经过洗涤、裂解、Ni2+亲和层析纯化和分子筛层析纯化后，进行HPLC分析，证实目的蛋白的纯度可达95．20％

6、。表明已获得高纯度的目的蛋白。6Westernblot证实重组蛋白可特异性地与HIV阳性血清发生免疫反应。表明所获得的目的蛋白可作为抗原检测抗gpl20抗体。7以纯化后的目的蛋白作为抗原，制备间接ELISA方法检测抗HIV抗体的试剂盒，对10份HIV国际标准血清进行检测，检测的灵敏性和特异性均达到100％。表明该试剂盒可用于HIV-1gpl20抗体的检测。结论：I成功构建了重组表达质粒pET-22b-120。2重组表达质粒可高效表达目的蛋白。3纯化得到高纯度的目的蛋白。4目的蛋白抗原性良好。5重组目的蛋白可作为抗原制备HIV-lgpl20抗体检测试剂盒。该试剂盒可用于血清中抗HI

7、V-lgpl20抗体的检测。中文摘要关键词：人免疫缺陷病毒1型，gpl20．基因克隆，基因表达，蛋白纯化。荚文捕要Clone，expression，purification，identification+andprimaryapplicationofHIV-1gpl20genefragmentABSTRACTobjective：HumanImmunodeficiencyVirus(HIV)isthecauseofAcquiredImmunodeficiencySyndrome(A