大鼠nogo基因片段的克隆及与gst融合蛋白的表达和纯化论文

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1、大鼠Nogo基因片段的克隆及与GST融合蛋白的表达和纯化论文张萍程希平费玲玲王春婷杨浩陈镔复鞠躬【关键词】Nogo基因CloningofadultratNogogenesegmentsandexpressionandpurificationoftheircodingproteinfusedents,expressefficientlyinE.coliandpurifythetargetproteins.METHODS:NogogenesegmentsplifiedbyRTPCRfromnormaladultSDratspinalcor

2、dtotalRNA.Aftersequenced,thereconstructedexpressionvectorsedigestionandsubclonedintoexpressionvectorpGEX4T1.ThenthevectorsedintoE.coliDH5α.RebinantGSTfusionproteinsn.RESULTS:ThesequencesofclonedadultratNogogenesegments(570-691and1028-1089amineacidresidues)entshavebeensu

3、ccessfullyclonedandefficientlyexpressedinE.coli,andtheGSTfusedtargetproteinshavebeenpurifiedtohighpurity.【Keyacia公司；pGEMTeasy载体、RTPCR试剂盒及Tvector试剂盒、各种限制性内切酶、连接酶及TaqDNA聚合酶均为美国Promega公司产品；DNA酶和高纯质粒提取试剂盒为德国BoehringerMannheim公司产品；IPTG,DTT,DTE,胱胺、谷胱甘肽琼脂糖及还原性谷胱甘肽，均为Sigma公司产品；

4、其余一般化学试剂均为国产分析纯.成年SD大鼠由第四军医大学实验动物中心提供.1.2方法1.2.1Nogo片段的扩增取成年SD大鼠的脊髓，按照Trizol操作指南提取总RNA，并以此为模板进行RTPCR，扩增Nogo氮端623~640氨基酸残基及胞外段的1024~1089氨基酸残基的cDNA片段，分别命名为NogoN和Nogo66.NogoN的引物序列如下：5′端引物：5′GGAATTCACAGCACAGCTTTGCCCAT3′，3′端引物：5′GCGTCGACTTAATCTGGACTTGGCTCAGTGGA3′；Nogo66的引物序列

5、如下：5′端引物：5′GGAATTCTATAAGGGCGTGATCCAGG3′，3′端引物：5′AACTGAGGCGGCTTTTCTTATAAGTCGACGC3′.48℃45min反转录，94℃变性，55℃复性1min5个循环，60℃复性1min30个循环.1.2.2RTPCR产物的克隆与鉴定回收RTPCR产物，与质粒pGEMTEasy进行连接反应，转化感受态DH5α.挑取白色菌落进行酶切鉴定，所获阳性克隆命名为pGEMNogoN和pGEMNogo66，送至上海申友公司进行测序.经EcoRⅠ，SalⅠ双酶切后与经同样酶切的pGEX4T

6、1进行连接反应，挑选的阳性克隆子命名为pGEXNogoN和pGEXNogo66.1.2.3目的蛋白的诱导表达和纯化工程菌在含氨苄青霉素（100mgL-1）的LB培养基中过夜培养，按10%的接种量进行转接，250rmin-1,37℃摇菌至A600=1，加入异丙基βD硫代半乳糖苷至终浓度为0.5mmolL-1，37℃继续通气培养4~5h.取1.5mL菌液，7734g离心30s收集菌体，菌体加入H2O60μL，剧烈振荡混匀，再加入4×样品缓冲液20μL，100℃，5min；7734g离心5min；100gL-1SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，

7、预计相对分子质量（Mr）32和39×103处有明显的蛋白表达.大规模培养细菌，诱导表达目的蛋白，收集菌体，超声破菌.离心后将上清和沉淀分别制样，进行SDSPAGE.可溶的目的蛋白直接应用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析柱进行亲和层析纯化.以包涵体形式存在的表达产物.用N十二烷基肌氨酸钠将沉淀蛋白质变性过夜，经缓慢透析去除N十二烷基肌氨酸钠，令蛋白复性后，用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析柱对目的蛋白进行亲和层析纯化.2结果2.1Nogo片段的扩增及序列测定RTPCR扩增Nogo66和NogoN的部分cDNA，分别得到182bp和384bp的片段（Fig1

8、）.挑取含插入片段的阳性克隆pGEMNogoN和pGEMNogo66，用高纯质粒提取试剂图1NogoN和Nogo66RTPCR扩增结果(略)盒提取质粒，测序结果表明所扩增的NogoN和Nogo66与GeneBank公布的