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《gst_talin1融合蛋白的原核表达及纯化》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、第25卷第3期生物学杂志Vol125No132008年6月JOURNALOFBIOLOGYJun,2008GST2talin1融合蛋白的原核表达及纯化1,22吴爽,耿建国(1广东药学院基础学院组织胚胎教研室,广州510006;2中科院生化细胞研究所分子细胞生物学实验室,上海200031)摘要:应用PCR方法扩增talin1的cDNA,并将其重组入谷胱甘肽转硫酶融合基因表达载体pGEX24T21中,获取人源的GST2talin1融合蛋白,为下阶段深入的研究talin1的结构、功能、及其与之相互作用的蛋白打下基础。经酶切、序列鉴定,选择
2、正确重组子,将其质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,用GlutathioneSepharose4B柱纯化,westernblot鉴定。克隆得到了一个2400bp的talin1的cDNA片断,重组质粒目的DNA测序正确,纯化出分子量约为12116kD的融合蛋白。用基因工程方法使GST2talin1重组质粒在原核细胞表达并成功纯化出GST2talin1融合蛋白。关键词:talin;P2选凝素;GST2融合蛋白;亲和层析中图分类号:Q51文献标识码:A文章编号:1008-9632(2008)03-0033-03P-选凝素
3、(P-selectin)是一种由细胞产生的粘物公司产品。附分子(adhesionmolecules),存在于细胞表面,能够介1.2方法导细胞与细胞间或细胞与基质间相互接触和结合。其1.2.1目的基因的扩增及纯化根据已公布的人源在炎症反应、凝血机制、甚至在某些肿瘤转移等方面发talin1的cDNA序列设计talin1的引物,上游引物T1的[1]挥重要作用。一直以来P2selectin受到许多研究者序列为5′23′atcagtaggaattcatgcgggacctagaccagg;的青睐。P2selectin分子的特性到目前为止,人们已
4、有下游引物T2的序列为5′23′gaagtcatctcgaggtgctcatc较丰富的研究。本实验室以P2selectin的cytoplasmictcgaagctctg,在上下游引物中分别加入EcoRI和XhoIdomain为饵从人白细胞cDNA文库中筛选到几个基酶切位点。PCR反应总体积为50μL,包括ddH2O因,经测序可知其中之一为talin1(从第1672个氨基酸4015μL、10×buffer5μL、4dNTP1μL、上下游引物各残基到蛋白末端)。因此本试验利用重组DNA技术,1μL、模板1μL、LaTaq酶015μL。反
5、应条件为:94℃获得talin1的cDNA,构建了GST2talin1融合蛋白表达2min,94℃50s、56℃50s,72℃2min,72℃5min,共35载体,在大肠杆菌中表达并纯化该融合蛋白,为进一研个循环。所获得的PCR产物以1%的琼脂糖凝胶电泳究talin1与P2selectin是否存在相互作用及相互作用机进行鉴定。将目的条带切下,用DNA片断快速纯化回制,奠定了基础。收试剂盒回收。1材料和方法1.2.2pGEX24T212talin1重组质粒的构建将纯化的1.1材料PCR产物和pGEX24T21载体用EcoRI和XhoI
6、双酶切1.1.1菌株、质粒人源talin1的cDNA及融合表达后,分别回收酶切产物。取回收后的talin1片断载体pGEX24T21为实验室保存。DH5α及BL21大肠815μL,载体片断015μL,10×T4DNA连接酶buffer杆菌感受态购自上海申能博采生物公司。1μL,T4DNA连接酶013μL,16℃连接过夜。1.1.2生化试剂和分子生物学试剂引物由上海生1.2.3重组质粒的筛选和鉴定将连接产物全量转工生物有限公司合成,限制性内切酶、T4DNA连接酶化入DH5α感受态细菌,在含有氨苄青霉素(Amp)的购自Promega公司
7、,1kbDNAMarker、DNA片断快速纯LB上37℃筛选培养过夜。次日挑取单个菌落,培养化及回收试剂盒购自北京鼎国生物技术公司,PCR试12h后小量抽取质粒,用EcoRI和XhoI双酶切,筛选阳剂购自日本TAKARA公司,氨苄青霉素为上海华舜生性重组质粒并送上海英骏生物技术有限公司测序。收稿日期:2007-12-22;修回日期:2008-01-11作者简介:吴爽(1979-),女,硕士,助教,教学和研究方向,细胞生物学,E2mail:wushuang21977@163.com;通迅作者:耿建国(1955-),男,博士,研究员,研
8、究方向,细胞粘连与迁移。33第25卷第3期生物学杂志Vol125No132008年6月JOURNALOFBIOLOGYJun,20081.2.4融合蛋白的诱导表达将测序正确的重组质融合蛋白和GST蛋白。按常规方法进行westernbl
