鼠hmgb1蛋白的原核表达及分离纯化

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1、鼠HMGB1蛋白的原核表达及分离纯化赵中夫杨慧刘明社张芸杨柳絮封江南【关键词】高迁移率族蛋白1；原核表达载体；纯化　　摘要目的：克隆小鼠HMGB1基因，构建原核表达载体，在大肠杆菌中诱导表达并分离纯化获得His-HMGB1的融合蛋白。方法：脂多糖刺激后的RAGB1的目的片段，克隆于pMD-19T载体，再亚克隆至含有pelB引导肽及His-标签肽的高效表达载体pET-26b(+)，转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导后行SDS-PAGE鉴定目标蛋白表达，用镍鳌合琼脂糖凝胶亲和层析法分离纯化含His-标签肽的目的蛋白。结果：经PCR扩增出大小为648bp的HM

2、GB1基因片段，成功构建目标蛋白的融合表达载体，经诱导表达及分离纯化，获得了约30kD的融合蛋白。结论：构建HMGB1的融合表达载体，获得分离纯化融合蛋白His-HMGB1，为进一步研究其生物学功能奠定了基础。　　关键词高迁移率族蛋白1；原核表达载体；纯化　　MouseHMGB1ProkaryoticExpressionandPurification　　AbstractObjective:ToclonemouseHighmobilitygroupbox1(HMGB1)geneandconstructtheprokaryoticexpressionvector,toi

3、nduceandpurifytheexpressedfusionproteinHMGB1.Methods:ThetotalRNAmouseRAD-19T.ThebinantvectorplateforPCRingE.coliBL21(DE3)andfourhoursinductionbyIPTG,HMGB1expressionconfirmedbySDS-PAGEandthepurificationedbyNi2+-chelateaffinitychromatograph.Results:ThetargetDNAsequenceofHMGB1idpET-26b(+)

4、-HMGB1obilitygroupbox1;Prokaryoticexpressionvector;Purification　　高迁移率族蛋白B1(Highmobilitygroupbox1，HMGB1)是广泛存在于真核细胞内的高度保守的非组蛋白染色体蛋白，基本组全长648bp编码215个氨基酸残基〔１〕。已有研究表明，HMGB1可由巨噬细胞或单核细胞等主动分泌，或由坏死细胞被动释放，从而作为一种炎症晚期因子参与脓毒症等病理过程〔２，３〕。研究还发现经脂多糖（LPS）刺激巨噬细胞后HMGB1的分泌量较未刺激明显增多，并且在8h～12h达峰值。而HMGB1发挥作用的

5、机制还不是很清楚。因此，分离纯化HMGB1蛋白将对进一步研究HMGB1的生物学功能、与其他细胞因子的相互作用关系等有重要意义。本实验以小鼠巨噬细胞RAGB1的目标序列，构建pMD-19T-HMGB1重组载体,亚克隆至高效表达载体pET-26b(+)，诱导表达并分离纯化含His-标签肽的HMGB1融合蛋白。　　1材料和方法　　1.1材料小鼠RAD-19T克隆载体购自大连宝生物工程有限公司；pET-26b(+)表达载体购自Novagen公司；TrizolRNA抽提试剂购自Invitrogen生物公司；PCR及胶中DNA回收纯化试剂盒、小规模质粒DNA提取纯化试剂盒购自中

6、鼎生物技术有限公司；各种限制性内切酶、TaqDNA聚合酶及DNA标准Marker购自大连宝生物工程有限公司；T4DNA连接酶购自北京纽英伦生物技术公司；低分子量标准蛋白Marker购自MBIFermentas公司。引物由武汉伯杰生物技术公司合成；测序送上海英骏生物技术有限公司。　　1.2方法　　1.2.1PCR引物的设计：以小鼠HMGB1cDNAGeneBank（NM010439.2）查询的有效序列为模板，首轮PCR引物为：上游f1：5＇-CGGGATCCCACTGGGCGACTCTGTGCCT-3＇（引入BamHⅠ酶切位点及两个保护碱基），下游r1：5＇-CGGA

7、ATTCTGCGCTAGAACCAACTTATTCATC-3＇（引入EcoRⅠ酶切位点及两个保护碱基）。HMGB1目标基因的扩增引物：上游hmgb1-f25＇-CGGGATCCGATGGGCAAAGGAGATCCTAAAA-3＇（引入BamHⅠ酶切位点及两个保护碱基），下游hmgb1-r25＇-CCCTCGAGTTCATCATCATCATCTTCTTCTTCA-3＇（引入XhoⅠ酶切位点及两个保护碱基)。　　1.2.2总RNA的抽提及RT-PCR：选择生长面积达瓶底70%的RAGB1的697bp片段，克隆至pMD-19T载体后转化大肠杆菌DH5α，经酶切鉴定及序