鼠hmgb1蛋白的原核表达及分离纯化论文

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1、鼠HMGB1蛋白的原核表达及分离纯化论文赵中夫杨慧刘明社张芸杨柳絮封江南【关键词】高迁移率族蛋白1；原核表达载体；纯化摘要目的：克隆小鼠HMGB1基因，构建原核表达载体，在大肠杆菌中诱导表达并分离纯化获得His-HMGB1的融合蛋白。方法：脂多糖刺激后的RAGB1的目的片段，克隆于pMD-19T载体，再亚克隆至含有pelB引导肽及His-标签肽的高效表达载体pET-26b(+)，转化大肠杆菌BL21（DE3）.freelouseHighmobilitygroupbox1(HMGB1)geneandconstructtheprokaryoticexp

2、ressionvector,toinduceandpurifytheexpressedfusionproteinHMGB1.Methods:ThetotalRNAmouseRAD-19T.ThebinantvectorplateforPCRingE.coliBL21(DE3)andfourhoursinductionbyIPTG,HMGB1expressionconfirmedbySDS-PAGEandthepurificationedbyNi2+-chelateaffinitychromatograph.Results:ThetargetDNAs

3、equenceofHMGB1idpET-26b(+)-HMGB1obilitygroupbox1;Prokaryoticexpressionvector;Purification高迁移率族蛋白B1(Highmobilitygroupbox1，HMGB1)是广泛存在于真核细胞内的高度保守的非组蛋白染色体蛋白，基本组全长648bp编码215个氨基酸残基［１］。已有研究表明，HMGB1可由巨噬细胞或单核细胞等主动分泌，或由坏死细胞被动释放，从而作为一种炎症晚期因子参与脓毒症等病理过程［２，３］。研究还发现经脂多糖（LPS）刺激巨噬细胞后HMGB1的分泌量

4、较未刺激明显增多，并且在8h～12h达峰值。而HMGB1发挥作用的机制还不是很清楚。因此，分离纯化HMGB1蛋白将对进一步研究HMGB1的生物学功能、与其他细胞因子的相互作用关系等有重要意义。本实验以小鼠巨噬细胞RAGB1的目标序列，构建pMD-19T-HMGB1重组载体,亚克隆至高效表达载体pET-26b(+)，诱导表达并分离纯化含His-标签肽的HMGB1融合蛋白。1材料和方法1.1材料小鼠RAD-19T克隆载体购自大连宝生物工程有限公司；pET-26b(+)表达载体购自Novagen公司；TrizolRNA抽提试剂购自Invitrogen生物

5、公司；PCR及胶中DNA回收纯化试剂盒、小规模质粒DNA提取纯化试剂盒购自中鼎生物技术有限公司；各种限制性内切酶、TaqDNA聚合酶及DNA标准Marker购自大连宝生物工程有限公司；T4DNA连接酶购自北京纽英伦生物技术公司；低分子量标准蛋白Marker购自MBIFermentas公司。引物由武汉伯杰生物技术公司合成；测序送上海英骏生物技术有限公司。1.2方法1.2.1PCR引物的设计：以小鼠HMGB1cDNAGeneBank（NM010439.2）查询的有效序列为模板，首轮PCR引物为：上游f1：5′-CGGGATCCCACTGGGCGACTC

6、TGTGCCT-3′（引入BamHⅠ酶切位点及两个保护碱基），下游r1：5′-CGGAATTCTGCGCTAGAACCAACTTATTCATC-3′（引入EcoRⅠ酶切位点及两个保护碱基）。HMGB1目标基因的扩增引物：上游hmgb1-f25′-CGGGATCCGATGGGCAAAGGAGATCCTAAAA-3′（引入BamHⅠ酶切位点及两个保护碱基），下游hmgb1-r25′-CCCTCGAGTTCATCATCATCATCTTCTTCTTCA-3′（引入XhoⅠ酶切位点及两个保护碱基)。1.2.2总RNA的抽提及RT-PCR：选择生长面积达瓶底7

7、0%的RAGB1的697bp片段，克隆至pMD-19T载体后转化大肠杆菌DH5α，经酶切鉴定及序列分析证实为目标序列，将此重组载体命名为pMD-19T-HMGB1。以pMD-19T-HMGB1为模板，进行二次PCR扩增，反应条件为：94℃5min预变性，然后（94℃30s；57℃25s；72℃40s）×30个循环，最后72℃5min。经1%琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪下观察，回收648bpHMGB1目的片段的PCR产物。1.2.3原核表达载体的构建与鉴定：PCR产物连接于pMD-19T载体，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得的重组质粒命名为

8、pMD-HMGB1。用BamH+XhoⅠ进行双酶切，回收的目的片段亚克隆至经同样双酶切的原核表达载体pET-26b(+)，