乙脑病毒e蛋白的原核表达、纯化及初步鉴定论文

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1、乙脑病毒E蛋白的原核表达、纯化及初步鉴定论文高淑娴，张伟，任君萍，雷迎峰，丁天兵，宋建华，马文煜，徐志凯【Abstract】AIM:ToconstructgeneencodingJapaneseencephalitisvirus(JEV)envelopeglycoproteinandtoexpressEproteininBL21(DE3).METHODS:UsingRTPCR,thegeneencodingEproteinplified.ThegeneidpET286HisEedintoBL21(DE3).The6HisEproteinexpressedinBL21(E

2、D3)inedbySDSPAGEand.E蛋白为糖蛋白，包裹在病毒的表面，它决定着病毒的毒力及其宿主范围，不仅在与宿主细胞受体结合及随后的膜融合中发挥重要作用，而且可刺激产生中和抗体［2］.我们对E蛋白进行了原核表达、纯化及鉴定，为进一步研究病毒的受体和病毒的感染机制提供了有利条件.1材料和方法1.1材料pET28a(+)表达载体和XL10,BL21(DE3)宿主菌为本试验室保存.P1，P2引物合成及序列测定由三博远志生物技术有限责任公司完成；限制性内切酶、PMD18T，EXTaq聚合酶和连接试剂盒（宝航公司）；逆转录试剂盒（Invitrogen公司）；JEV鼠源性mA

3、b和兔源多克隆抗体由本实验室制备；猴抗鼠红外标记二抗、羊抗兔红外标记二抗（Rockland公司）；红外成像系统（LICOR公司）；高速低温离心机（BECKMAN公司）；恒温摇床（上海智城公司）.1.2方法1.2.1片段的扩增及表达载体的构建用Trizol提取JEVRNA，以8μLRNA为模板,1μLP1为引物,1μLdNTP65℃水浴5min,冰浴1min,2μL10×RT缓冲液,4μL25mmol/LMgCl2,.freelin；加1μLsuperscriptTM混匀；42℃水浴50s；70℃水浴15min；加1μLRAaseH混匀；37℃水浴20min；将得到的产物进行P

4、CR扩增，5′端引物：5′CGCTCGAGTTAAGCATGCATTGGTCGCTAA3′；3′端引物：5′CGGAATTCTTTAATCGTTGTCTGGGAATGGGCAATCGTGAC3′.反应条件为：94℃5min，94℃50s；55℃1min；72℃1min30s,30个循环，72℃15min.10g/L琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，回收目的片段.将回收的PCR产物克隆入PMD18T载体中转化EcoliE..XL10感受态细胞，EcoRⅠ和XholⅠ酶切鉴定，阳性克隆送公司测序；测序正确后，EcoRⅠ和XholⅠ双酶切PMD18TE质粒和表达载体pET2

5、8a,回收目的片段,连接；转EcoliE..XL10感受态细胞；挑克隆；提取质粒；酶切鉴定载体构建.阳性克隆质粒转化表达宿主菌BL21(DE3)；提取质粒；酶切鉴定；阳性克隆保留菌种.1.2.2工程菌的诱导表达及可溶性分析用载体构建成功的菌种划抗性平板，挑取单克隆在37℃培养至A600nm为0.4～0.6，加入100mg/LIPTG诱导4h.1000r/min,4℃10min离心收菌.弃上清后用PBS洗菌体，用去离子水重悬菌体.加入2×SDS上样缓冲液进行样品处理.另离心收集菌体，以溶液STE(50mmol/LTris﹒Cl(pH8.0),1mmol/LEDTA,100mmo

6、l/LNaCl)重悬菌体，超声破菌（间隔10s,超声8s,共15min）.分别收集上清和沉淀，上清用5×SDS上样缓冲液处理，沉淀用1×SDS上样缓冲液处理后彻底重悬.取上述各样品做SDSPAGE用2.5g/L考马斯R25溶液室温染色2h后脱色.1.2.3重组蛋白的鉴定同上取上清和沉淀样品分别进行处理并做SDSPAGE，随后将电泳蛋白转移到NC膜上（转移缓冲液：甘氨酸39mmol/L,Tris碱48mmol/L,SDS3.7mg/L,甲醇200ml/L），100V转移80min后用25mmol/LTBS平衡NC膜10min,用0.5g/L的脱脂奶4℃封闭5h，用TBS·T

7、洗膜3次,10min/次，1∶200稀释JEV鼠源性mAb，1∶100稀释JEV兔源性多抗，4℃孵育过夜，然后用TBS·T洗膜3次，10min/次，再与1∶2500稀释的猴抗鼠抗体和羊抗兔抗体分别孵育，4℃作用90min后洗膜3次，10min/次，然后进行扫描分析.1.2.4重组蛋白的纯化参照Qiagen公司镍离子亲和层析柱（NiNTA）操作说明进行.离心收集500mL诱导宿主菌，冰浴15min；按5mL/g湿菌的比例加入含8mol/L尿素的缓冲液B(pH8.0),室温下轻轻搅拌使细菌裂解