原核表达及纯化总结

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1、His标签重组蛋白大量表达及纯化一筛选及鉴定1将构建好的连接产物进行转化DH5α鉴定表达载体和目的片段的连接一般为10µL连接体系，此步转化方法如下：取100µLDH5α感受态细胞，加入到10µL连接产物体系中↓冰上放置30min↓42℃准确热激90秒↓冰上放置3min↓加入300µL无Amp+的LB培养基，37℃100rpm/min振荡培养1h↓将400μL菌液全部涂LB平板（含Amp+）水平放置30min待菌液完全吸收后，在37℃温箱中倒置培养过夜（12~16h），直至出现单菌落。2阳性克隆的PCR鉴定方法如下挑取单

2、菌落于200μL含Amp+LB培养基中（用2.0的离心管），摇床200rpm/min，37℃培养4h，待菌液浑浊后，取1μL做菌液PCR鉴定。PCR扩增体系如下：取1μL菌液作为模板反应体系如下：模板1µL10×PCR反应缓冲液（含Mg2+）2µLdNTP(2.5mmol/L/each)1.6µL上游引物（10µmol/L）1µL下游引物（10µmol/L）1µLTaq酶（5U/µL）0.3µLddH2O13.1µLTotal20µL条件：94℃预变性10min94℃变性45s50℃退火45s72℃延伸1min，30个循

3、环的扩增反应72℃延伸10min4℃∞1%琼脂糖凝胶电泳检测：电泳上样时：MarkerDL2000上样3µL样品（1µLloadingbuffer+6µLPCR产物混匀上样）100V，20min；紫外透射仪检测，出现目的带的对应菌落为阳性克隆。（注意：记得保存菌种）3阳性克隆质粒抽提取阳性克隆菌液200µL，加3ml含Amp+LB液体培养基，37℃200rpm/min培养3-4h，待菌液浑浊后，进行质粒抽提。质粒抽提方法如下：取1.5mL菌液于1.5mL离心管中↓12000rpm离心30s，弃上清↓加800μLSTE悬浮

4、沉淀↓12000rpm离心30s，弃上清↓重复STE漂洗沉淀的过程↓加入100μL预冷的solutionⅠ，强烈振荡混匀↓温和加入200μLsolutionⅡ（solutionⅡ现用现配），盖紧管口快速颠倒5次，放置冰上2min至溶液清亮而粘稠↓极温和加入150μL预冷的solutionⅢ，倒置温和振荡10s，冰上放置5min↓12000rpm离心5min↓取上清（400μL），加入等量的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），振荡混匀↓12000rpm离心5min↓取上清（350μL），加入1/10体积（35μL）的NaA

5、c（3M）和2倍体积预冷的无水乙醇（700μL）上下颠倒5次，（无水乙醇在-20℃保存）↓室温放置20min（-20℃沉淀效果更好）13000rpm离心10min↓弃上清（小心倒出），用1ml70%的乙醇贴壁冲洗漂洗沉淀↓13000rpm离心10min室温放置让乙醇挥发干净↓用20μlTE溶解质粒DNA，每20μL体系中加入1μL1mg/mL的Rnase，37℃作用30min，1%琼脂糖电泳定量检测纯度所用试剂：1、STE：0.1mol/LNaCL10mmol/LTris-HCL(pH8.0)1mmolol/LEDTA2

6、、solutionⅠ：50mmolol/LGlucose25mmolol/LTris-HCL（pH8.0）10mmolol/LEDTA(pH8.0)3、solutionⅡ：0.2mol/LNaOH1%SDS4、solutionⅢ：5mol/LKAc60mL冰醋酸11.5mL无菌水28.5mL(最终K+的浓度为3mol/L，Ac-的浓度为5mol/L)4BL21的转化及诱导表达质粒转化BL21感受态细胞方法如下：取100µLBL21感受态细胞，加入1µL质粒↓冰上放置30min↓42℃准确热激90秒↓冰上放置3min↓加入

7、900µL无Amp+的LB液体培养基，37℃100rpm/min振荡培养1h↓取100μL菌液全部涂LB平板（含Amp+）水平放置30min待菌液完全吸收后，在37℃温箱中倒置培养过夜（12~16h），直至出现单菌落。5目的蛋白的诱导表达挑取单克隆菌落于3ml的LB液体培养基（含Amp+）中180rpm/min，37℃培养。待菌液浓度OD600≈0.6时开始诱导：1.首先取出50µL菌液留样2.1:1000向剩余菌液中加0.8M的IPTG3µL3.30℃180rpm/min诱导4h收菌6目的蛋白SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴

8、定1.取700μL菌液13000rpm离心1min，弃上清2.空菌对照及marker3.加30μLPBS和30μL2×SDS上样缓冲液，用枪吹匀4.沸水煮10min，稍离心，将液体汇聚管底，取10µL上样12%的胶浓缩胶90V10min分离胶160V50min考马斯亮蓝染色30min脱色液脱色二大量诱导表达1．取30