蛋白原核表达与纯化-(新生培训）

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1、蛋白的原核表达与纯化策略ZHEJIANGUNIVERSITYChengCY2012-11-10PartⅠ蛋白的原核表达PartⅡ蛋白纯化PartⅠ蛋白的原核表达1原核表达概述2原核表达策略选择3表达结果检测4常见问题与实验例大肠杆菌(Escherichiacoli)最通用的原核表达系统遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高；基本不分泌，易形成包涵体(缺乏正确折叠的蛋白结构)，无蛋白加工等修饰；常见的原核表达载体：pET系列(T7promoter，Novagen公司)；pQE系列(T5promoter，Qiag

2、en公司)；pGEX系列(GST融合表达，GE公司)；pBAD系列(Arabinose诱导型)目的基因扩增目的基因插入表达载体重组基因转化入宿主菌中外源基因的表达外源基因在大肠杆菌中表达流程“基因——载体——菌株——培养”系统名称公司启动子抗性常用标签特点pGEXGEtacAmpGST·Tag可溶性表达，纯化难以控制，谷胱甘肽一步洗脱，得到的蛋白纯度较低,通常需要去掉GST·TagpMalNEBtacAmpMBP·Tag可溶性表达，纯化难以控制，麦芽糖一步洗脱，得到的蛋白纯度较低,通常需要去掉MBP·TagpETMerck(Novag

3、en)T7T7lacAmpKanHis·Tag种类丰富。标签小，无需切割，一般来说，对蛋白活性无影响。纯化及其方便。pEASYTransgenT7lacAmpHis·Tag同pET系统常用原核表达载体系统pET表达载体系统pET系统最初由Studier及其同事构建(StudierandMoffatt,1986)，是有史以来在E.coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统；目的基因被克隆到pET质粒上，受噬菌体T7强转录及翻译信号控制；表达有宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。T7RNA聚合酶机制十分有效并具有选择性：充分诱导时，几

4、乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白，诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。pET各种表达载体特性T7lac启动子:表达更加严谨T7启动子融合标签常用于蛋白检测与纯化。有时也可增加蛋白可溶性、将蛋白运转至特定位置。考虑因素细胞特性蛋白稳定性蛋白酶缺陷型——B型菌株，缺失lon、ompT蛋白酶多种常用表达菌株均为此类，如BL21、Origami、Rosetta等启动子tac启动子需要大肠杆菌自身的RNA聚合酶即可：BL21T7启动子需要能够提供T7RNA聚合酶的细胞：DE3溶源菌抗性细胞不能与载体带有相同的抗性

5、：pET-28a+OrigamiB(DE3)No！pET-21b+OrigamiB(DE3)Yes！严谨调控BL21(DE3)pLysS/BL21(DE3)pLysE稀有密码子Rosetta系列溶解性Origami系列：Origami，OrigamiB和Rosetta-gami稀有密码子：不同生物使用密码子存在偏爱性。某种或某几种tRNA的缺乏，会导致外源目的基因的mRNA无法正常在E.coli里表达，是为“稀有”密码子。表达菌株的选择表达条件的优化常用表达条件的优化培养基组分：葡萄糖会抑制cAMP形成，进而抑制表达，严谨调控，无其他严

6、谨调控手段（pLysS）且毒基因时，至关重要温度：影响表达速率、蛋白可溶性与活性IPTG：浓度影响表达速率、蛋白可溶性与活性其他因素：培养基体积与通气37℃摇床培养到OD600=0.4-0.1（建议OD600为0.6）约3-4小时可达到；从中取出一些样品作为未诱导对照，在剩下的样品中加入IPTG至终浓度0.4（T7启动子）或1mM（T7lac启动子），继续培养3-4小时；菌体5000g，4℃离心。如果需要，收集上清进行进一步分析；重悬细胞于1/10体积预冷的20mMTris-HCl或50mMPBS（pH8.0）中离心；除去上清，菌体保存

7、于-70℃冰箱或继续纯化。常规的诱导条件表达策略的选择实验目的表达策略活性分析可溶表达制备抗原包涵体高纯度融合标签结构研究天然蛋白…………根据实验目的选择表达策略选择表达载体选择表达菌优化表达条件选择表达载体系统名称公司启动子抗性常用标签特点pGEXGE(Pharmacia)tacAmpGST·Tag可溶性表达，纯化难以控制，谷胱甘肽一步洗脱，得到的蛋白纯度较低,通常需要去掉GST·TagpMalNEBtacAmpMBP·Tag可溶性表达，纯化难以控制，麦芽糖一步洗脱，得到的蛋白纯度较低,通常需要去掉MBP·TagpETMerck(

8、Novagen)T7T7lacAmpKanHis·Tag种类丰富。标签小，无需切割，一般来说，对蛋白活性无影响。纯化及其方便。pEASYTransgenT7lacAmpHis·Tag同pET系统选择表达