黄粉甲抗冻蛋白原核表达、纯化及活性检测

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1、摘要：昆虫抗冻蛋白具有较高的抗冻活性，生物体内微量的抗冻蛋白很难满足诸多方面应用。因此，探索出生产抗冻蛋白的有效方法亟待解决。本研究基于此目的利用基因工程的技术和方法开展了抗冻蛋白基因的分子克隆和表达工作。以黄粉甲为材料，提取40c冷处理4周的黄粉甲脂肪体总RNA：运用R1二PcR技术扩增和克隆出了吃廖72，嘶，84口，q珍8袖，睨勿8和，睨加占4d，斫，8和六个黄粉甲抗冻蛋白基因，并在Genbank中注册。其中基因q彩72经核酸和蛋白水平分析确定为新的黄粉甲抗冻蛋白基因，目的基因q和72，q勿8和与其它抗冻蛋白基因具有高度同源性(分别达到79．48％和98．81％)，分别编码7

2、2和84个氨基酸的成熟蛋白，AFP72缺少由12氨基酸组成的的重复单元，保守单元1’XT在不同序列中具有高度保守性。将基因吃舻力，斫7占妇与载体pMAL-c2x和pMAL—p2x双酶切后连接，构建两个融合表达质粒pMAL—c2x一咖72，pMAL-c2x-q和84盯和两个分泌融合表达质粒pMAL-p2x．力，pMAL_p2x．8和：表达质粒转化E∞，fTBI后，经IPTG诱导表达，目的蛋白表现为可溶性；通过优化组合，最适的发酵条件是：诱导温度为25。c，初始诱导菌浓度氏00为O．6左右，诱导时间为8小时，IPTG浓度为0．5r衄。儿。超声波细胞破碎法使融合蛋白AFP72从含有融合

3、表达质粒pMAL．c2x．斫，刀的细胞中释放。对于分泌融合表达质粒pMAL—p2x一吃瑶坫4盯，Mgs04溶解法与超声波细胞破碎法均能使目的蛋白从细胞中释放，Mgs04的最适浓度为O．05mmol／L。在最优条件下融合蛋白AFP84a和AFP72分别占总可溶蛋白的40．5％和38．9％；运用亲和层析和分子筛层析纯化后，sDs—PAGE显示目的蛋白呈单一条带；生物活性实验检测目的蛋白具有一定的抗冻活性。关键词：黄粉甲；抗冻蛋白；RT_PcR；序列分析；融合蛋白；发酵条件；亲和纯化；分子筛层析；抗冻活性Abstract：ThethermalhysteresisactivityofaI

4、ltifkezeproteinsisatleastanorderofmagn“udegreaterininsectthan也atobtainedinothero唱anisms．Ane丘bctivemetllodproducinga11ti舶ezeproteillsisallticipated．Fortllispurposemolecularclonjnga11deXpressionofallti船ezcproteingenesbythetechniquesa11dmethodsofgeneengilleeringwercpedb肌ediIlthisresearch．TbtaIRN

5、Awasextractedf硒mt11efatsof跆聆e6，如聊D胁D，exposuredforfollrweeksofcold(40c)．sixgenes(卯72，卯84d，卯占46，q本，84c，q存坫4d，∞84已)wereobtainedbyR1二PCR．Amongtllem，吃勿72isanovelami仔eezeproteillgenethrou曲肌alyzingcDNAfull—lengIllandsequenceof锄inoacids．Theaimgenes咖刀aIld咖8如sharedhigllhomolo盱丽t11otlleranti矗℃ezepmteill

6、genesof乃聊6，fomoZffD，(94．8％a11d98．81％肋cleotidesidenti够respectiVely)，wllichcaIlcodeman鹏peptidesof72aaand84aarespectiVely．AFP72isintegcrof12aa-repeatlHlitsshorterthanotherami丹eezepmteinsinlength．AaeraimgencsweresubclonedintoeXpressingplasmidspMAL—c2XandpMAL—p2X，tWorecombinationexpressingplaslIli

7、dspMAL—c2X一曲72，pMAL—c2x一卯占亭口andtwosecreterecombiⅡationexpressingplasmidspMAL—p2X一咖72，pMAL-p2X-印占4Ⅱ、vereconstmcted．AndtllentheobjectivegeneswereeXprcssedinE枷TBI．An叩ticalfeHnentcondmonwasthefollowing：theconcemationofE∞疗(A600=0．6)beforeinduction