panton—valentine杀白细胞素原核表达、纯化及生物学活性鉴定

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1、·6·安徽医科大学学报ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2011Jan；46(1)Panton—Valentine杀白细胞素原核表达、纯化及生物学活性鉴定常文娇。，马筱玲，沈继龙，高朋，戴媛媛，张翠萍‘，周馨。，周文静摘要目的原核表达金黄色葡萄球菌Panton—Valentine杀1材料与方法白细胞素(PVL)蛋白，并进行生物学活性鉴定。方法提取PVL阳性金黄色葡萄球菌DNA，利用PCR扩增LukF—PV和1．1实验材料LukS—PV编码基因，亚克隆入表达载体pET28a，转化人大肠1．1．1质粒和菌株产PVL金葡菌菌株为本科室埃希菌(Ecolt

2、)BL21株，经异丙基一B—D硫代半乳糖苷保存，属ST30，SCCmecIV型。大肠埃希菌XL1．blue、(1PTG)诱导表达，纯化后获得可溶性的蛋白，Westernblot对DH5oL、表达宿主菌B[21(DE3)和表达载体pET28a其鉴定。并以人多形核粒细胞(PMNs)为靶细胞检测其生物均由教育部省部共建重要遗传病基因资源利用重点学活性。结果成功构建了LukF—PV和LukS—PV基因的表实验室提供；克隆载体pMD18-T载体购自大连宝达载体，经1PTG诱导和亲和层析纯化法获得重组蛋白，Westernblot鉴定证实其为重组PVL蛋白。实验表明该蛋白生物技术有限公司。具

3、有诱导人多形核粒细胞(PMNs)凋亡的作用。结论成功1．1．2主要试剂ExTaqs酶、限制性内切酶BamH地表达获得了具有生物学活性的PVL重组蛋白，为PVL快I、XhoI、PCRMarker(DI2000)、低分子量蛋白质速检测方法的建立和致病机制研究奠定基础。Marker、鼠源性抗His抗体、HRP标记山羊抗小鼠主题词杀白细胞素类／遗传学；基因表达；细胞凋亡；葡萄IgG等均购自大连宝生物技术有限公司；硝酸纤维球菌，金黄色素膜(NC膜)为浙江四青生化材料厂产品；蛋白纯自由词Panton—Valentine杀白细胞素化试剂盒His·BandPurificationKit购自No

4、vagen公中图分类号R341；R378．11；R394．2；R394．3司；人中性粒细胞分离液购自TBD公司；凋亡细胞文献标识码A文章编号1000—1492(2011)01—0006—05检测试剂盒购自BenderMedsystems公司；其他试剂均为国产分析纯。Panton—Valentineleukocidin(PVL)是金黄色葡1．2实验方法萄球菌(金葡菌)分泌的一种双组分(LukF—PV、1．2．1目的基因的获得及原核表达载体的构建LukS—PV)成孔细胞毒素蛋白，是金葡菌重要的致病煮沸法制备PVL阳性金葡菌DNA模板，具体提取因子之一。PVL蛋白的两种组分同时发挥生

5、物学活方法详见参考文献，PCR方法克隆分别扩增出不性，以七聚体形式在宿主细胞膜上形成孔道，损伤细带有引导肽的LukF—PV和LukS．PV基因。(去引导胞膜，进而导致多形核白细胞(PMNs)，巨噬细胞和肽后的引物如下：LukF．PVP1：5．ACGCG．单核细胞的损伤，与重症肺炎、皮肤和软组织等感染垒!GCTCAAcATATCACAccTGTAAG一3，LukF—相关。近年来，产PVL金葡菌感染病例日益增PVP2：5一ACCG!垒TrAGCTCATAGGA3TI33'多，携带PVL基因的金葡菌毒性明显增强，其引起TTCCTrAGATrG一3；LukS—PVP1：5一ACGC的感

6、染具有特殊的临床症状，致死率高，逐渐成为一GATCCGAATCTAAAGCTGATAACAATATI"GAGAATA个严重的世界性问题。本研究旨在通过分子生物学TTG一3，LukS—PVP2：5ACCG垒TCAATrAT·技术，克隆表达纯化获得PVL蛋白LukF—PV和GTcc1]-rCACrITrAArI丫I1CATGAG一3)两端分别引入LukS．PV组分，并进行生物学活性鉴定，为进一步的限制性内切酶BamHI和XhoI酶切位点。目的基研究和应用打下基础。因分别与pMD18-T连接后，转化入XL1．blue菌，2010—06—25接收挑阳性菌落扩增培养后，抽提质粒，测序正确

7、后，经基金项目：安徽省2007年度科技攻关计划(编号：07010302192)限制性内切酶BamHI和XhoI酶切，并与酶切后的作者单位：安徽医科大学附属省立医院检验科，合肥230001表达载体pET28a连接，转化入表达宿主菌BL21。教育部重要遗传病基因资源利用重点实验室，合肥1．2．2重组质粒的诱导表达及纯化将含有230032LukF—PV和LukS．PV编码基因的菌液涂板，37~C活作者简介：常文娇，女，硕士研究生；马筱玲，女，教授，硕士生导师，责任作者，E—mail：xiaolin