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《拟南芥Alpha_dioxygenase1的原核表达_纯化及活性的检测.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、华北农学报·2008,23(3):9212拟南芥Alpha2dioxygenase1的原核表达、纯化及活性的检测1,21121,31,3张小梅,韩念法,张美祥,李广录,范三红,郭蔼光(1.西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;2.河南科技大学农学院,河南洛阳471003;3.陕西省农业分子生物学重点实验室,陕西杨凌712100)摘要:从经水杨酸处理的拟南芥开花期植株中获得cDNA,扩增得到Alpha2dioxygenase1(DOX1)基因,进行原核表+达、纯化和生物活性检测。利用原核表达载体pMAL2c4x
2、在T7ExpressCompetentE.coli和BL21(DE3)2RIPLcodon菌株+中表达DOX1,经AmyloseResin亲和层析柱纯化。SDS2PAGE结果表明,重组融合蛋白在BL21(DE3)2RIPLcodon中的表达通过灰度值比较分析以可溶性为主,表达率约3.7%,纯化的DOX1纯度可达45%。愈创木酚法表明,可溶性重组蛋白不具有过氧化物酶活性;2,42DNP法测试表明可溶性重组蛋白具有脂肪酸双加氧酶活性。关键词:Alpha2dioxygenase1;重组表达;2,42DNP;亲和纯化;活性中图分类
3、号:Q786文献标识码:A文章编号:1000-7091(2008)03-0009-04Expression,PurificationandActivityAnalysisofArabidopsis2dioxygenase11,211ZHANGXiao2mei,HANNian2fa,ZHANGMei2xiang,21,31,3LIGuang2lu,FANSan2hong,GUOAi2guang(1.CollegeofLifesciences,NorthwestAgricultureandForestryUniversity,
4、Yangling712100,China;2.CollegeofAgronomy,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang471003,China;3.KeyLaboratoryforMolecularBiologyofAgricultureofShaanxiProvince,Yangling712100,China)Abstract:RecombinantDOX1wasclonedintopMAL2c4xexpressionvectorandexpressedinE.co
5、liT7Express+CompetentE.coliandBL21(DE3)RIPLcodon.Purifiedusingamyloseresincolumn,afusionproteinabout114kDwas+detectedbySDS2PAGEintheIPTGinducedrecombinantBL21(DE3)RIPLcodonstrain,andit′syieldaccountsfor317%ofthetotalbacterialproteins,thepurityofrecombinantproteinw
6、asabout45%.Thesolublefusionproteinhadun2detectableperoxidaseactivitybytheguaiacolmethod;Thealphadioxygenaseactivityofthepurifiedproteinwastestedus2ing2,42DNP,resultshowedthatthesolublefusionproteinhaddetectablealpha2dioxygenaseactivity.Keywords:Alpha2dioxygenase1;
7、Recombinantexpression;2,42DNP;Affinitypurification;Activity生物在长期的进化过程中,形成了独特的一套辅助途径。催化脂肪酸Alpha氧化的酶是一种双加响应外界环境胁迫的生理及生化过程。这个适应性氧酶,1998年在病原入侵的烟草叶片中首次克隆到包括了一系列复杂的过程:如胁迫信号的受体感应、该基因,命名为PIOX(Pathogeninducedoxyge2[1]细胞间的信号传递、细胞内信号级联放大效应、基因nase)。根据在重组烟草PIOX及拟南芥中同源的的表达调控模式改
8、变、胁迫后恢复正常状态的调节加氧酶分析表明,该酶为alpha双加氧酶(α2dioxyge2[2]等。特别是在信号传递及基因表达调控方面,多不nase)。在拟南芥中α2dioxygenase有2个同源基[2]饱和脂肪酸氧化物具有重要的作用。而合成脂氧化因,分别命名为α2dioxygenase1(DOX1)
