拟南芥转录因子TDF1的原核表达及多克隆抗体制备.pdf

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1、第39卷第2期上海师范大学学报(自然科学版)Vo1．39．No．22010年4月JournalofShanghaiNormalUniversity(NaturalSciences)Apr．，2010拟南芥转录因子TDF1的原核表达及多克隆抗体制备周茜，曹志林2，俞俞，杨仲南(1．上海师范大学生命与环境科学学院，上海200234；2．河南工程学院资源与环境学院，郑州451191)摘要：在拟南芥花药发育过程中，MYB家族转录因子TDF1在调控绒毡层发育及后期功能上起到关键的作用．利用PCR方法扩增TDF!基因并克隆到原核表达载体pET一32a．将表达

2、载体TDF1一pET32a转入大肠杆菌BL21(DE3)，用IPTG成功诱导表达了分子量约为56KD的TDF1融合蛋白．该融合蛋白主要以包涵体形式存在，分离出包涵体后进行可溶性处理作为抗原免疫家兔．制备出的多克隆抗血清经ELISA测定效价为1：2560，Westernblot检测表明该抗血清与TDF1融合蛋白识别良好．TDF1抗体的制备有助于进一步从生化水平上研究TDF1在花药发育中的功能．关键词：原核表达；拟南芥；转录因子；TDF1；融合蛋白；多克隆抗体中图分类号：Q511文献标识码：A文章编号：1000．5137(2010)02-0175-0

3、60引言转录因子是指与靶基因启动子中的顺式作用元件发生特异性相互作用，并对转录过程起激活或抑制作用的DNA结合蛋白．MYB家族转录因子以保守的DNA结合域为共同特征，是植物最大的转录因子家族之一，R2R3一MYB转录因子是植物中数目最多的一类MYB蛋白，其N．端都含有包含2个重复的螺旋一转角一螺旋的R2R3DNA结合结构域．花药是植物的雄性生殖器官，是花粉发育的场所．绒毡层在花药发育过程中起着至关重要的作用，它释放酶复合物降解胼胝质，提供花粉发育所必需的营养物质，并参与调控花粉外壁的形成．TDF1基因编码了一个拟南芥细胞核定位的R2R3．MYB家

4、族转录因子．在花药发育早期，该转录因子特异性地在绒毡层，花粉母细胞和小孢子中高效表达．该基因突变，绒毡层发育异常，其功能出现紊乱，导致花粉不能形成，突变体呈雄性不育表型J．但是在生化水平上，TDF1在花药发育中的具体功能还不清楚．抗体的制备是在生化水平上研究蛋白质功能的一个重要途径．根据制备的原理和方法，抗体可分为多克隆抗体，单克隆抗体和基因工程抗体，其中多克隆抗体的制备方法比较成熟，过程简单，因此被广泛应用．由于一种抗原有多个不同的抗原决定簇，B淋巴细胞克隆可以识别每一个抗原决定簇，并产生出针对它们的抗体，因此这种异种免疫血清中含有的抗体是多克

5、隆抗体]．利用原核表达的蛋白免疫动物来制备多克隆抗体是一种十分有效的方法．在本研究中，克隆获得TDF1基因，并构建了原核表达载收稿日期：2009·11—25基金项目：国家自然科学基金(30770206)．作者简介：周茜(1985～)，女，上海师范大学生命与环境科学学院硕士研究生；杨仲南(1965一)，上海师范大学生命与环境科学学院教授．通讯作者．176上海师范大学学报(自然科学版)体TDF1．pET32a，将其转入大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导后在原核细胞中成功表达了这个蛋白．该融合蛋白主要以不溶的包涵体形式表达，以洗涤纯化溶解后的包

6、涵体作为抗原免疫家兔，制备出了效价较高，特异性较强的多克隆抗体，这些工作为进一步用生化手段研究该转录因子的DNA结合位点和下游基因奠定了基础．1材料与方法1．1试剂和材料1．1．1质粒与菌株pMD18一T载体购自大连宝生物工程(TaKaRa)有限公司；原核表达载体pET-32a(+)购自北京鼎国生物技术有限公司；大肠杆菌感受态菌株DH5a及BL21(DE3)由本实验室提供．1．1．2生物学试剂T4DNA连接酶、限制性内切酶SacI、XhoI和PrimestarDNA聚合酶购自大连宝生物工程(TaKaRa)有限公司；福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂、d

7、NTPs、PCR产物回收试剂盒、Tris、SDS、TEMED及IPTG等常用分子生物学试剂购自北京鼎国生物技术有限公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG、ECL化学发光检测试剂盒、PVDF膜购自艾比玛特生物医药(上海)有限公司；引物由Invitrogen公司合成．1．2方法1．2．1TDF1基因的克隆参照GenBank中序列设计用于扩增TDF1基因的引物．上游引物序列为TDF1F：5一AAGAGCTCAT—GGGAAGACCTCc1TrG1TrG．3，含有SacI位点；下游引物序列为TDF1R：5一AACTCGAGATAATCGAAAT

8、-CATrCAAGAGTFGA一3，含有XhoI位点．以实验室现有的含TDF1基因的质粒作为PCR模板．PCR反应体系为：10×buff