溶藻弧菌附着定植因子ACFA原核载体构建、表达条件优化及多克隆抗体制备.pdf

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1、华北农学报·2015，30(1)：35．41溶藻弧菌附着定植因子ACFA原核载体构建、表达条件优化及多克隆抗体制备刘祥(陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西汉中723001)摘要：为构建水产致病菌溶藻弧菌附着定植因子ACFA原核表达载体，优化ACFA蛋白的诱导表达条件，制备ACFA蛋白小鼠多克隆抗体。通过分子克隆获得ACFA蛋白的表达菌株，利用切胶纯化获得ACFA蛋白，免疫小鼠制备多克隆抗体，采用ELISA法检测抗体滴度为1：3200倍，Western—Blotting法检测抗血清特异性较好。通过正交试验，获得AC

2、FA菌株的最佳表达条件为：诱导时菌液OD。。值0．5，加IPTG终浓度0．3mmol／L，诱导时间8h，诱导温度32℃；最佳培养条件为：葡萄糖浓度0，转速230r／min，装液量50mL。关键词：溶藻弧菌；ACFA蛋白；正交试验；多克隆抗体中图分类号：Q816文献标识码：A文章编号：1000—7091(2015)O1—0035—07doi：10．7668／hbnxb．2015．01．007ConstructionProkaryoticVector，OptimizationExpressionConditionsan

3、dPolyclonaiAntibodyPreparationofVibrioalginolyticusAccessoryColonizationFactorACFALIUXiang(CollegeofBiologicalSciencesandEngineering，ShaanxiUniversityofTechnology，Hanzhong723001，China)Abstract：ToconstructprokaryoticexpressionvectorofaquaticpathogenicVibrioalgi

4、nolyticusaccessorycoloni-zationfactorA(ACFA)，optimizetheexpressionconditionofACFAandpreparethepolyclonalantibodiesofmouseanti—ACFA．TheACFAexpressionstrainwasobtainedbymolecularclone．ACFAwaspurifiedbythewayofthegelslices，immunizedmiceandpreparedthepolyclonalant

5、ibody．Theantibodytiterwas1：3200byELISA，andWest—ern·Blottingprovedthattheantiserumhadgoodspecificity．Bythemethodoforthogonalexperiment，theoptimalin—ducingexpressingconditionofACFAprotein：strainOD600value，IPTGfinalconcentration，inducingtimeandtem-perature，whichw

6、ere0．5，0．3mmol／L，8h，32℃，respectively；theoptimalculturecondition：glucoseconcentra—tion，rotationrate，andmediumvolume，whichwere0，230r／minand50mL，respectively．Keywords：Vibrioalginolyticus；ACFAprotein；Orthogonalexperiment；Polyclonalantibody溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)

7、为革兰阴性菌，ACFs)是最近几年发现的细菌致病菌毛调控蛋分布于海域、河口地区，是水产养殖引起弧菌病暴发白⋯，研究发现其基因家族包括，、、a~C以的主要病原，发病率及死亡率高¨；也可引起人类及aCO，合成的蛋白增强其对小鼠肠道的黏附作胃肠道疾病与伤口感染；是一种人和海洋动物共感用，同时提高毒性⋯。其中附着定植因子A(Ac—染的病原菌。目前，防治弧菌疾病主要使用抗cessorycolonizationfactorA，ACFA)是弧菌重要毒力生素，尚无商业化疫苗的生产，难以避免出现食蛋白之一，为d螺旋与无规则卷曲构成的

8、分泌型蛋品安全与环境污染问题。白¨；c端表现出较强同源性，可能在蛋白跨膜结附着定植因子(Accessorycolonizationfactors，构、维持细菌稳定性，以及促进细菌有效定植于宿主收稿日期：2014—09—05基金项目：陕西省教育厅科学研究计划项目(2013JK0723)；陕西理工学院人才启动项目(SLGQD13—15)作者简介：刘祥(1983一