小鼠b7h4原核表达载体的构建、表达及多克隆抗体的制备

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1、小鼠B7H4原核表达载体的构建、表达及多克隆抗体的制备作者：肖德乾，肖欢，胡国艳，那志萍，郑淑华，刘伟，张良清，徐军发【摘要】目的探讨小鼠B7H4原核表达载体的构建、表达及多克隆抗体的制备。方法采用特异性引物扩增小鼠B7H4（mB7H4）胞外功能区DNA，经酶切、拼接构建原核表达载体pET28amB7H4。将构建的重组表达质粒转化入E.coliBL21(DE3)菌株，采用IPTG诱导表达、NiNTA柱亲和层析纯化目的蛋白、SDSPAGE分析蛋白纯度。将纯化的目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体，并对其进行纯化及鉴定。结果序列测定证实了构建的pET28amB7H4重组表达载

2、体含有mB7H4编码序列，其序列分析与GenBank中公布序列对比一致，质粒在E.coli中诱导表达相对分子质量(Mr)为26.5KD的目的蛋白，SDSPAGE分析表明纯化后的目的蛋白达到电泳纯。双向琼脂扩散法检测抗体效价为1∶16，ELISA法检测抗体效价为1∶12800，Westernblot分析显示抗体能特异性结合mB7H4。结论成功制备了高表达重组mB7H4蛋白的原核表达载体及高效价抗mB7H4多克隆抗体，为进一步研究B7H4的功能奠定了基础。【关键词】B7H4；原核表达载体；基因表达；多克隆抗体13　　Abstract:ObjectiveTostudytheco

3、nstructionandexpressionofaprokaryoticexpressionvectorformurineB7H4andpreparationofapolyclonalantibody.MethodsMurineB7H4(mB7H4)genewasamplifiedwithspecificprimers.ThePCRproductwasdigestedwithenzymesandthenligatedtoreconstructrecombinantprokaryoticexpressionvectorpET28amB7H4thatexpressesthemo

4、useB7H4and6Hisfusionprotein.TheexpressionvectorwastransformedintoE.coliBL21(DE3)andinducedwithIPTGtoexpressmB7H4fusionproteinthatwasthenpurifiedwithNiNTAPurificationSystemandanalyzedwithSDSPAGE.Thepurifiedfusionproteinwasusedtopreparepolyclonalantibodywithrabbit.ResultsThesequenceanalysiscon

5、firmedthatthisrecombinantexpressionvectorcontainedmB7H4codingsequencethatwasidenticalwiththepublishedsequenceinGenBank.Theplasmidexpresseda26.5kDprotein.AfterpurifiedwithNiNTAPurificationSystem,theresultedproteinwasanalyticallypureaccordingtotheanalysiswithSDSPAGE.Thetiteroftheantiserumwere1∶

6、16and1∶12800detectedbydoublediffusiontestandELISA,respectively.WesternblotanalysisdemonstratedthattheantimB7H4antibodyboundspecificallytomB7H4.ConclusionTheprokaryoticexpressionvectorandtheantiserumformB7H4were13preparedsuccessfully,whichestablishedafoundationforthefurtherstudyofB7H4.　　Keyw

7、ords:B7H4;prokaryoticexpressionvector;geneexpression;polyclonalantiserum　　B7H4（B7x，B7S1）是T细胞活化的共抑制分子（coinhibitor），其mRNA广泛表达于淋巴样和非淋巴样组织（如肺、睾丸、胰腺、前列腺），但其蛋白质在各种组织中不表达或低表达，而在树突状细胞（DC）、单核细胞、巨噬细胞、B细胞和T细胞表面诱导性表达［14］。跨膜型B7H4和可