人cyclin e原核表达载体的构建及表达论文

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1、人CyclinE原核表达载体的构建及表达论文.freelaprotein,Rb)、转录因子E2F、抑癌基因p53、KIP家族、CDK2、4、5等相互作用共同决定细胞的生存和凋亡。而一旦细胞进入S期CyclinE即被泛素化降解。细胞周期调控是当前肿瘤学研究的热点,细胞周期调控异常与肿瘤发生密切相关。为此,我们构建人CyclinE基因的原核表达载体,并在E.coliBL21中表达,为今后发现并研究CyclinE/Cdk2的新底物奠定了基础。1材料和方法1.1材料EcoRI,XhoI,T4DNA连接酶均购自TaKaRa公司。质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒均购自Tiangen公司。AntiRa

2、bbitIgGHRP购自美国Promega公司。IPTG购自Merk公司。DNAladder由北京Tiangen公司提供。pDESTCyclinE载体、pET32a(+)载体、E.coliBL21、及兔源antiCyclinE抗体,由本实验室保存。1.2方法1.2.1人CyclinE的PCR扩增根据CyclinE的序列设计特异性引物,将其从pDESTCyclinE载体上克隆。上游引物序列为:acgtgaattcatgaaggaggacggcggcgc;下游引物的序列为:tagcctcgagtcacgccatttccggcccgctg,其中下划线分别为EcoRI与XhoI酶切位点,引物

3、均由北京英骏公司合成。PCR反应条件:95℃5min,95℃1min,50℃45s,72℃1min,循环30次后,72℃延伸5min。1.2.2原核表达载体pET32a(+)CyclinE的构建用EcoRI、XhoI分别酶切PCR产物与pET32a(+)质粒,经琼脂糖凝胶回收,将载体和目的片段用T4连接酶4℃连接过夜。将连接的重组质粒pET32a(+)CyclinE转化E.coliDH5α,在含有50mg/L氨苄的LB琼脂糖培养基中于37℃培养过夜。挑选阳性克隆,扩增后提取质粒,并用EcoRI与XhoI酶切鉴定。1.2.3人HisCyclinE融合蛋白的诱导表达将重组质粒pET32a

4、(+)CyclinE转化E.coliBL21,在含50mg/L氨苄的LB培养基中摇菌过夜,后以1∶100转接到新鲜的含50mg/L氨苄的LB培养基。37℃摇菌2.5h后,加入IPTG至终浓度0.6mmol/L,37℃诱导4h,5000r/min离心10min收菌。菌体用PBS洗涤1次,后加入超声液(20mmol/LNa2HPO4,0.5mol/LNaCl,10mmol/Limidazole,1mmol/LPMSF)重悬,以超声5s,间隔10s,全程时间20min,保护温度8℃超声破菌,12000g离心20min,取上清进行SDSPAGE,分析HisCyclinE的诱导表达情况。1.2

5、.4人HisCyclinE纯化将HisCyclinE上清加入NiNTABeads中,4℃结合2h,加入5倍柱体积的r大约66000左右有明显的差异条带,与预期的理论值基本相符(图2)。将诱导纯化的蛋白做r397000和41000的蛋白。在细胞周期中CyclinE的表达水平随细胞周期波动,在G1晚期或S早期达高峰,之后迅速下降,主要与其周期性合成与降解有关5。CyclinE过表达有助于细胞从G1期提早进入S期,导致细胞增生及恶性增生.有文献报道在许多恶性肿瘤组织中CyclinE呈过量表达现象6。Peng等7研究了CyclinD1和CyclinE异常表达及在肝癌中的作用,发现71例肝癌患

6、者中有40例CyclinEmRNA过度表达,且与低分化肝癌密切相关,提示CyclinE的异常表达与肝癌生物学行为有关。CDK2的激酶活性需要CyclinE的结合,原核表达的CyclinE可与CDK2一起进行体外激酶反应的,对CDK2的底物的磷酸化研究有重要作用。同时,纯化的CycllinE可作为诱饵蛋白筛选与CyclinE/CDK2复合物相互作用的蛋白,对细胞周期尤其是G1/S检验点的调控机制的研究有重要意义。目前,CyclinE的表达在均为真核表达,蛋白的表达量都受到限制,为此我们参照文献8表达并纯化了人源CyclinE蛋白,该蛋白的原核表达及纯化在国内尚为首例。纯化的大量的his

7、cyclinE的蛋白,将对后续的体外激酶反应以及筛选与其相互作用的蛋白起到重要作用。同时,CyclinA作为与CDK1结合的蛋白,对细胞周期的调控也有重要影响,我们目前正着手其克隆及其原核表达。