人钙联蛋白s100a8原核表达载体的构建及表达

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1、人丰丐联蛋tlS100A8原核表达载体的构建及表达潘晓彦赵伟李琳刘叔文谭穗懿通讯作者(南方医科大学药学院广东广州510515)基金项目：国家自然科学青年基金(项目编号：81102482)【摘要】目的：构建人钙联蛋白S100A8的原核表达载体并进行蛋白表达及纯化，以便进一步研究。方法：从人单核巨噬细胞THP-1中提取总RNA,逆转录后进行PCR,得到目的基因，与TA克隆载体pMD-T进行连接，得到pMD-S100A8质粒，经BamHI和Xhol双酶切产物或者PCR产物双酶切后，与大肠杆菌pGEX-6P-l表达载体

2、进行连接，得到PGEX-S100A8重组质粒。重组质粒转入E.coliBL21(DE3)表达菌进行蛋白表达。融合GST蛋白用GST柱纯化，冷冻干燥，进行下一步研究。结果：成功构建了TA克隆质粒pMD-S100A8及阳性pGEX-S100A8重组质粒，成功诱导蛋白的原核表达。结论：纯化得到的蛋白为进一步研究S100A8钙联蛋白的结构和功能提供了参考。【关键词】钟联蛋白；S100A8；质粒构建；表达；纯化【中图分类号】R453【文献标识码】B【文章编号】1003-5028(2013)10-0307-02近年来，对S

3、100A8/A9的研究主要着重于二者及其低聚物在炎症及肿瘤中的应用和作用机制［1］。在炎症方面，主要针对其在炎症中所起的作用，其对炎症的影响机制机理以及与花生四烯酸和嘌呤之间的相互作用［2,3］。木文拟构建原核表达重组质粒PGEX-S100A8,诱导蛋白原核表达并进行纯化，以得到大量纯化蛋白，以对其结构及功能进行更深入的研究。1资料与方法11一般资料111细胞，菌株及质粒：人单核巨噬细胞THP-1由南方医科大学药学院吴曙光教授提供；菌株DH5α由木实验室保存，菌株BL21(DE3)购自上海EXcel

4、lBiology公司；载体pGEX-6P-l由复旦大学上海医学院陆路副教授惠赠，载体pMD-T购自TAKARA公司。112主要试剂:RNA提取试剂盒，逆转录试剂盒，普通PCR试剂盒,BamHI和Xhol内切酶以及T4连接酶均购自TAKARA公司；DNA胶冋收试剂盒购自OMEGA公司；Bugbustermix裂解液，his-tag羊抗鼠单抗以及羊抗兔二抗购自Merck公司，S100A8兔抗人单抗购自SantaCruz公司。12方法121S100A8DNA片段的来源从GenBank查找得到S100A8基因序列(CR

5、4076741)，进行引物设计：Sense:5’-(BamHI)GGATCCATGTTGACCGAGCTGGAG-3’,Antisense:3’-(Xhol)CTCGAGCTACTCTTTGTGGCTTTCT-5’。PCR产物09%的琼脂糖凝胶电泳，以β-actin做对照，用DNA回收试剂盒回收0的DNA片段。122质粒构建:将冋收的DAN片段TA兑隆至pMD-T载体，转化入大肠杆菌DH5α菌株，涂布于含有X-gal的氨苄抗性LB平板，用蓝白

6、斑进行筛选。连接产物琼脂糖凝胶电泳冋收得到pGEX-S100A8质粒。123诱导表达:将构建好的质粒pGEX-S100A8转化入人肠杆菌DH5α，涂布于氨辛抗性LB平板得到再次筛选，挑取单克隆小量提取质粒，测序正确后进行保种。第2d以1:100接种于100ml含有氨苄的LB培养基，37°C,220rpm,摇3〜4h,测得OD600在06〜08之间吋，开始加入IPTG达到终浓度为05mM,28°C,220rpm,诱导12h。124蛋白纯化:诱导表达后，取预先称重的50ml离心管收集菌体，5000g离心

7、30min,求得菌体重量，加入Bugbustermix裂解液，按Bugbustermix说明书步骤裂解菌体，离心后取上清。用045μm的滤膜过滤后，过滤液上GST柱，用尿素洗脱，洗脱后的缓冲液中即为带有GST标签的0的蛋白S100A8。2结果21S100A8PCR基因扩增产物的鉴定S100A8蛋白基因大小为279bp,llKD左右。提取的RNA做逆转录PCR，基因产物跑09%的琼脂糖凝胶电泳，以β-actin作为对照，成功扩增出S100A8蛋白基因(见图1)。（图1）1DNAMarker；2&b

8、eta;-actinPCR产物阳性对照；3〜5S100A8DNAPCR产物。（图2）1WideRangeDNAMarker（500-15,000）；2〜3Pgex-6p-l空载体对照；4〜6Pgex-6p-l与S100A8链接产物。22pGEX-6p-l-S100A8载体的构建PCR冋收的S100A8DNA片段，以及载体pGEX-6p-l经BamHI和Xhol双酶切，冋收后，做链接，以