β分泌酶原核表达载体的构建、表达及融合蛋白纯化

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1、β分泌酶原核表达载体的构建、表达及融合蛋白纯化作者：朱爱华李敬陆军钱进郑元林【摘要】目的构建小鼠β分泌酶原核表达载体并诱导其表达和纯化，为进一步研究β分泌酶的作用奠定基础。方法根据基因文库中小鼠β分泌酶基因的cDNA序列设计引物，采用RTPCR方法扩增到β分泌酶的cDNA片段，克隆进原核表达载体pET28a中，并转化大肠杆菌BL21(DE3)，测序鉴定后，通过IPTG诱导表达出目的蛋白，经亲合层析纯化。结果从小鼠的脑组织RNA中扩增出特异的β分泌酶基因片段长1506bp，经酶切鉴定及DNA序列测定，证实重组载体pET28aBACE构建正确，表达融合蛋白分子量约为55kD

2、，经镍离子亲合柱层析纯化获得电泳级纯度的目的蛋白。结论在大肠杆菌中获得了小鼠β分泌酶的高效表达，为进一步研究其生物学功能和应用奠定了基础。【关键词】β分泌酶；大肠杆菌；表达；融合蛋白【Abstract】ObjectiveTobuildmiceβsecretaseprokaryoticexpressionvectorandinduceitsexpressionandpurification,toaffordbasisforβsecretaseresearch.MethodsPrimerwasdesignedbymiceβsecretasegenecDNAinGenbank.cD

3、NAsegmentofβsecretasegenewasamplifiedbyRTPCR,thenclonedinto9prokaryoticexpressionvectorpET28aandtransformedintoE.coliBL21(DE3).Aftersequencedandidentified,fusionproteinwasinduced,expressedandpurified.ResultsSpecialβsecretasegenesegmentamplifiedfromRNAofmicebraintissuewas1506bp.Afteridenti

4、fiedandsequenced,recombinantvectorwasprovedcorrect,itsfusionproteinhadamolecularweightof55kD.Electrophoresispuritytargetproteincouldbeacquired.ConclusionsMiceβsecretasehasahighexpressioninE.coli,whichbuildabasisforresearchofβsecretase′sbiologicalfunctionanditsapplication.【Keywords】βsecretas

5、e;E.coli;Expression;Fusionprotein　　阿尔茨海默病(AD)是发病率最高，危害最大的中枢神经系统退变性疾病〔1〕。淀粉样斑块是其主要病理特征之一，主要成分β淀粉样蛋白(Aβ)在AD的发生、发展中起着重要作用，因此阻断或延迟AD早期Aβ的积聚成为治疗AD的切入点。β分泌酶(BACE)是淀粉样前体蛋白(APP)水解产生Aβ9的关键酶，是干预AD进程的理想靶点〔2〕。通过酵母或昆虫表达系统表达活性BACE在最近已见报道。然而，由于上述系统表达的蛋白量低，不适合BACE抑制剂的大规模筛选〔3，4〕。而BACE的原核表达可克服以上缺陷，为筛选特异性抑制剂

6、及研究BACE结构与功能关系提供大量材料，为最终从根本上治疗AD带来希望。本研究利用大肠杆菌表达系统，选用pET28a作为表达载体获得小鼠BACE，经镍离子固定金属亲和层析纯化目的蛋白，以便进一步研究其功能。　　1材料与方法　　1.1主要材料　　2月龄昆明小鼠(购自徐州医学院)；宿主菌E.coliBL21(DE3)(由本实验室保存)；质粒pET28a(购自Novagen公司)；限制性核酸内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、T4DNA连接酶等工具酶(购自大连宝生物工程公司)；Trizol试剂及AMV逆转录酶(美国Promega公司)；PfuDNA聚合酶及溶菌酶(上海生工生物工程公司

7、)；PCR纯化和胶回收试剂盒(购自上海华舜生物工程公司)；DNAmarker、中分子量蛋白质marker是Fermentas公司产品；镍离子亲合层析柱(Novagen公司产品)；其他化学试剂均为分析纯。　　1.2寡核苷引物的设计与合成　　根据基因文库中小鼠BACE基因的cDNA序列及相应的限制性核酸内切酶位点设计合成2条引物P1:5′TAGGATCCATGGCCCCAGCGCTGCACT3′(划线部分为BamHⅠ9酶切位点)；P2:5′CGGAATTCTTACTTGAGCAGGGAGATGTCA