hbvhev融合二价抗原原核表达载体构建及蛋白初步表达

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1、HBV/HEV融合二价抗原原核表达载体的构建及蛋白的初步表达要】 　　目的:构建一个能够表达出乙/戊型肝炎二价抗原的重组原核表达载体,并在E.coliBL21(DE3)中表达。方法:采用PCR方法扩增出HBV的S基因和HEV的ORF2编码区的羧基末端中的414～606aa的基因片段,将两片段连接后克隆入T载体,得到融合基因,将融合基因克隆入含有Ω增强子的pTΩTE高效的原核表达载体中,构建重组质粒pTΩT7SE。将pTΩT7SE转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导后用Westernblot鉴定融合蛋白。结果:获得全长为1284bp的融合的HBV/HEV

2、的基因片段。已构建的重组质粒pTΩT7SE转化E.coliBL21(DE3)后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量（Mr）约为50000重组蛋白。SDSPAGE分析显示,表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于胞质中,表达量约占全菌蛋白的30.52%。Westernblot结果表明在Mr为50000处可见特异性着色带。结论:成功构建了原核表达载体pTΩT7SE,并表达出目的蛋白,为研制预防乙型和戊型肝炎双价疫苗提供了实验技术基础。【关键词】 HBVHEV重组原核表达载体二价疫苗　　乙型肝炎（HBV）是危害全球人类健康最重要的传染病之一, 它除能够诱发急性或慢性肝炎外

3、, 还与人的肝硬化和肝癌等死亡率极高的疾病有直接的关系[1,2]。世界卫生组织估计2000年全球慢性HBV携带者达4亿人[3,4], 其中有可能发展为肝细胞癌。而戊型肝炎（HEV）病毒是戊型病毒性肝炎的病原体, 主要经消化道传播, 常通过饮用被HEV污染的水源而引起爆发性流行, 主要累及一些发展中国家, 散发性病例呈全球性分布。HEV对HBV的复制无影响, 但HEV感染会加重乙肝患者肝脏损害和临床症状, 并可推测HEV对乙型肝炎发展有促进作用[5]。   　　HBV的基因组位于衣壳内, 为3.2kb的不完全双链的开环DNA, 基因组共有4个公认的开放读框, 分别为编码包膜

4、蛋白HBsAg的s区, 编码衣壳的核心区(C区, HBcAg), 编码病毒聚合酶的P区, 以及编码X抗原(HBxAg)的X区。克隆HBSAg基因, 将其转入酵母中表达, 表达产物进行加工处理即成为目前广泛使用的基因工程疫苗[6]。而最早的戊型肝炎病毒重组研究是用大肠杆菌表达的。1992年Purdy等[7]将缅甸株HEVORF2的3′端大约三分之二基因片段插入pATH10, 在大肠杆菌中表达融合蛋白trpEC2。经Wersternblot分析证明, trpEC2具有很好的抗原性和广泛性。但目前即可以抗乙肝又可以抗戊肝的疫苗尚没有研究。为此本课题组展开此项研究, 将HBV

5、/HEV的融合基因SE, 克隆入融和表达载体pTΩTE中, 转化大肠杆菌BL21, 以期表达出融合蛋白。为进一步研究其免疫保护效果及制备抗乙肝和戊肝的双价DNA疫苗奠定了基础。　　1 材料和方法　　1.1 材料 T载体pTA2（从鼎国公司购买）;  pTΩTEE质粒（由厦门大学提供）;  大肠杆菌DH5α及BL21（DE3）;  pADR1质粒由由南京军区军事医学研究所朱进博士惠赠。乙肝和戊肝患者阳性血清及阴性对照血清来自于吉林省长春市肝胆病医院, 辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG购自Sigma公司。TaKaRaExTaq酶, T4DNA连接酶, EcoRI酶, X

6、hoI酶, NdeI酶（从宝生物公司购买）;  胰蛋白胨, 酵母提取物, IPTG, 甘油, DTT, Bis, Acr, Aps, 琼脂糖, 琼脂, 低Mr标准蛋白: markerDL15000;  λDNA/EcoRI和HindIII; TEMED, 硝酸纤维素膜, Tris等（从鼎国公司购买）;  蛋白转印PVDF膜（购自Millipore公司）;  Westernblot化学发光检测试剂盒（SuperSignalWestPicoTrailKit）（购自Pierce公司）;  Xray底片（购自Kodak公司）;  DYCZ24D双垂直电泳槽（北京六一仪器厂）;

7、  VE186转移电泳槽（上海天能科技有限公司）。　　1.2 方法　　1.2.1 目的基因的获取 PCR扩增乙型肝炎adr亚型的S基因[8]。上游引物F1: 5′CGGAATTCATGGAGAACACAAC3′（GAATTC为EcoRI酶切位点）。下游引物F2:5′CGCTCGAGTCAAATGTATACC3′（CTCGAG为XhoI酶切位点, 去除终止密码子）。由于上下游引物之间存在引物二聚体, 所以在PCR反应体系中, 先加上游引物, 设计程序为95℃, 4min。95℃, 30s;  57℃, 45s;  7