hbv-hev融合二价抗原原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

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1、HBV/HEV融合二价抗原原核表达载体的构建及蛋白的初步表达：何秀霞,于源华*,张春兰,荀恒杰【摘要】　　目的:构建一个能够表达出乙/戊型肝炎二价抗原的重组原核表达载体,并在E.coliBL21(DE3)中表达。方法:采用PCR方法扩增出HBV的S基因和HEV的ORF2编码区的羧基末端中的414～606aa的基因片段,将两片段连接后克隆入T载体,得到融合基因,将融合基因克隆入含有Ω增强子的pTΩTE高效的原核表达载体中,构建重组质粒pTΩT7SE。将pTΩT7SE转化E.coliBL21(DE3

2、),经IPTG诱导后用r）约为50000重组蛋白。SDSPAGE分析显示,表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于胞质中,表达量约占全菌蛋白的30.52%。r为50000处可见特异性着色带。结论:成功构建了原核表达载体pTΩT7SE,并表达出目的蛋白,为研制预防乙型和戊型肝炎双价疫苗提供了实验技术基础。【关键词】HBVHEV重组原核表达载体二价疫苗　　乙型肝炎（HBV）是危害全球人类健康最重要的传染病之一,它除能够诱发急性或慢性肝炎外,还与人的肝硬化和肝癌等死亡率极高的疾病有直接的关系[1,2]。

3、世界卫生组织估计2000年全球慢性HBV携带者达4亿人[3,4],其中有可能发展为肝细胞癌。而戊型肝炎（HEV）病毒是戊型病毒性肝炎的病原体,主要经消化道传播,常通过饮用被HEV污染的水源而引起爆发性流行,主要累及一些发展中国家,散发性病例呈全球性分布。HEV对HBV的复制无影响,但HEV感染会加重乙肝患者肝脏损害和临床症状,并可推测HEV对乙型肝炎发展有促进作用[5]。　　HBV的基因组位于衣壳内,为3.2kb的不完全双链的开环DNA,基因组共有4个公认的开放读框,分别为编码包膜蛋白HBsAg的s区

4、,编码衣壳的核心区(C区,HBcAg),编码病毒聚合酶的P区,以及编码X抗原(HBxAg)的X区。克隆HBSAg基因,将其转入酵母中表达,表达产物进行加工处理即成为目前广泛使用的基因工程疫苗[6]。而最早的戊型肝炎病毒重组研究是用大肠杆菌表达的。1992年Purdy等[7]将缅甸株HEVORF2的3′端大约三分之二基因片段插入pATH10,在大肠杆菌中表达融合蛋白trpEC2。经r标准蛋白:markerDL15000;λDNA/EcoRI和HindIII;TEMED,硝酸纤维素膜,Tris等（从鼎国

5、公司购买）;蛋白转印PVDF膜（购自Millipore公司）;in。95℃,30s;57℃,45s;72℃,50s,循环10次,72℃,10min。而后再加下游引物,再进行95℃,4min。95℃,30s;57℃,45s;72℃,50s,循环25次,72℃,10min。戊型肝炎ChinaD（GenBankNo:D11092.1）亚型的基因序列,以质粒pTΩTEE为模板进行ORF2编码区的羧基末端中的414～606aa的基因片段的PCR扩增。上游引物P1:5′CCATATGACATCTGTAGAG

6、AATGCTCAG3′（CATATG为NdeI酶切位点,去除启始密码子）下游引物P2:5′GAATTCGCGCGGAGGGGGGGC3′（GAATTC为EcoRI酶切位点,去除终止密码子）。PCR反应的设计程序为95℃,4min;94℃,30s;68℃,50s;72℃,50s,循环35次,72℃,5min。分别取PCR回收产物与pTA2载体连接,命名为pTA2S、pTA2E,转化后挑取阳性克隆进行PCR及酶切鉴定并测序。　　1.2.2pTΩT7SE重组质粒的构建分别回收由EcoRI/XhoI双

7、酶切pTA2S和EcoRI/NdeI双酶切pTA2E的目的片段,各取5μL与pTΩTE原核表达载体质粒用限制性内切酶XhoI和NdeI消化后回收的产物进行连接。将连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞。PCR鉴定pTΩT7SE重组质粒。　　1.2.3pTΩT7SE重组质粒的Southernblot鉴定为了进一步鉴定pTΩT7SE构建正确,以其作为模板,用随机引物法标记的pADR1质粒上的S基因的PCR产物和pTΩTEE为模板进行ORF2编码区的羧基末端中的414～606aa的基因片段的

8、PCR产物做探针,采用DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionKitII(ROCHE)进行Southernblot检测。　　1.2.4融合蛋白的原核表达将鉴定正确的重组质粒pTΩT7SE转化表达菌BL21(DE3),过夜培养,挑取单克隆在LB培养基(含有80mg/L的卡那霉素,15g/L的葡萄糖)中37℃,240r/min振荡培养过夜。再按1∶50转接到新的含有氨苄青霉素的LB培养基中,37℃震荡培养至A600为0.4时,