β分泌酶原核表达载体的构建、表达及融合蛋白纯化论文

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1、β分泌酶原核表达载体的构建、表达及融合蛋白纯化论文朱爱华李敬陆军钱进郑元林【摘要】目的构建小鼠β分泌酶原核表达载体并诱导其表达和纯化，为进一步研究β分泌酶的作用奠定基础。方法根据基因文库中小鼠β分泌酶基因的cDNA序列设计引物，采用RTPCR方法扩增到β分泌酶的cDNA片段，克隆进原核表达载体pET28a中，并转化大肠杆菌BL21(DE3)，测序鉴定后，通过IPTG诱导表达出目的蛋白，经亲合层析纯化。结果从小鼠的脑组织RNA中扩增出特异的β分泌酶基因片段长1506bp.freeliceβsecretasep

2、rokaryoticexpressionvectorandinduceitsexpressionandpurification,toaffordbasisforβsecretaseresearch.MethodsPrimericeβsecretasegenecDNAinGenbank.cDNAsegmentofβsecretasegeneplifiedbyRTPCR,thenclonedintoprokaryoticexpressionvectorpET28aandtransformedintoE.coli

3、BL21(DE3).Aftersequencedandidentified,fusionproteinentamplifiedfromRNAofmicebraintissueolecularHⅠ、T4DNA连接酶等工具酶(购自大连宝生物工程公司)；Trizol试剂及AMV逆转录酶(美国Promega公司)；PfuDNA聚合酶及溶菌酶(上海生工生物工程公司)；PCR纯化和胶回收试剂盒(购自上海华舜生物工程公司)；DNAmarker、中分子量蛋白质marker是Fermentas公司产品；镍离子亲合层析柱(Nova

4、gen公司产品)；其他化学试剂均为分析纯。1.2寡核苷引物的设计与合成根据基因文库中小鼠BACE基因的cDNA序列及相应的限制性核酸内切酶位点设计合成2条引物P1:5′TAGGATCCATGGCCCCAGCGCTGCACT3′(划线部分为BamHⅠ酶切位点)；P2:5′CGGAATTCTTACTTGAGCAGGGAGATGTCA3′(划线部分为EcoRⅠ酶切位点)。由上海生工生物工程公司合成。1.3RTPCR迅速分离小鼠的大脑皮层组织，Trizol试剂提取总RNA，反转录后得到cDNA，以P1和P2做

5、为上、下游引物，设置PCR参数：为94℃5min；94℃30s,55℃45s,72℃90s,循环30次,72℃10min,扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行分析,.freelHⅠ和EcoRⅠ双酶切后克隆进入经同样双酶切的pET28a质粒中，获得pET28aBACE重组质粒，并转化DE3感受态细胞，筛选、鉴定阳性克隆。1.5融合蛋白的诱导表达挑取含有质粒pET28aBACE的DE3一单菌落，接种于50ml含有50μg/ml卡那霉素的液体LB培养基中，37℃恒温振荡培养过夜，按1%的接种量接种到新鲜的含50μg/

6、ml卡那霉素的液体LB培养基中，37℃振荡培养。通过不同的诱导时间和异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)浓度优化其表达条件，12%SDSPAGE检测目的蛋白的表达。在扩大培养至A6000.4～0.6时加IPTG使终浓度1mmol/L，诱导表达5h后收集菌体。1.6融合蛋白的亲合纯化离心收集诱导后的菌体，溶菌酶裂解后，离心，上清和沉淀分别取样，12%SDSPAGE检测，确定目的蛋白所在部位。镍凝胶亲和层析法纯化目的蛋白，纯化后可得到经SDSPAGE电泳检测，考马斯亮蓝染色单一条带的蛋白。2结果2.1RT

7、PCR扩增结果将设计合成的引物，以逆转录合成的小鼠脑组织cDNA为模板,经PCR扩增后，1%琼脂糖凝胶电泳结果显示在1500bp左右的有一明显的DNA条带(图1)，与预期大小1506bp相符。2.2重组表达载体的鉴定获得的重组质粒进行酶切鉴定，产生预期大小的片段，见图2。通过DNA测序进一步确定成功构建了重组表达载体pET28aBACE，目的基因序列正确。2.3重组蛋白的表达含重组质粒pET28aBACE的DE3经IPTG诱导后1h出现新的蛋白质，就有融合蛋白的表达(图3)。随着培养时间的延长，融合蛋白的

8、表达量随之增加。但到4h后融合蛋白的表达达到高峰并处于稳定水平，随着诱导时间的增加没有明显变化。因此，在大规模发酵培养的时候，诱导后继续培养5h左右就可收获菌体。通过SDSPAGE电泳结果还证实，诱导剂加入4h后，融合蛋白的表达约占细菌总蛋白的30%左右。表明这一新的融合表达载体能以较高水平表达融合蛋白。2.4目的蛋白的纯化pET表达载体中Histag可以使融合蛋白利用亲合层析的方